检验技术1.ppt

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1、寄寄生生虫虫检检验验技技术术 广州医学院病原生物学教研室广州医学院病原生物学教研室 陈陈 代代 雄雄1/27/20231一、定义一、定义通过一定的通过一定的检验方法检验方法诊断诊断 寄生虫病寄生虫病之学问之学问 寄生虫病的实验室诊断方法寄生虫病的实验室诊断方法 1/27/20232二、范畴二、范畴n病原学诊断技术：粪检、血检等病原学诊断技术：粪检、血检等 n免疫学诊断技术：免疫学诊断技术：ELISAELISA、HIAHIA等等n核酸诊断技术：核酸诊断技术：PCRPCR、核酸探针等核酸探针等它们各有特点与用途，现分别介绍于下：它们各有特点与用途，现分别介绍于下：1/27/20233 病原学诊断技

2、术病原学诊断技术n定义：通过检获病原体进行寄生虫病诊定义：通过检获病原体进行寄生虫病诊断的方法断的方法n意意义义：它它通通过过从从患患者者体体内内或或其其排排泄泄、分分泌泌物物中中检检获获寄寄生生虫虫来来进进行行诊诊断断，因因而而具具有有确诊确诊价值。价值。n它是最重要的寄生虫病实验诊断方法。它是最重要的寄生虫病实验诊断方法。1/27/20234第一节第一节 粪便检查粪便检查最常用的寄生虫病原学诊断方法最常用的寄生虫病原学诊断方法 一一、定定性性诊诊断断方方法法：(有有无无？什什么么？)（一）肉眼检查与鉴定（一）肉眼检查与鉴定 1 1、虫体收集方法：、虫体收集方法：（1 1）拣虫法：大型肠道蠕

3、虫）拣虫法：大型肠道蠕虫 蝇蛆蝇蛆 蛔虫、姜片虫、带绦虫孕节蛔虫、姜片虫、带绦虫孕节 1/27/20235（2 2）水洗过筛法：检查肠道蠕虫）水洗过筛法：检查肠道蠕虫带绦虫头节带绦虫头节（3 3）水洗沉淀法：小型肠道蠕虫）水洗沉淀法：小型肠道蠕虫 钩虫、鞭虫、肝吸虫等钩虫、鞭虫、肝吸虫等1/27/202362 2、虫体检查与鉴定、虫体检查与鉴定（1 1）直接观察法：）直接观察法：大型蠕虫大型蠕虫 小型蠕虫小型蠕虫 肉眼观察肉眼观察 放大镜放大镜oror解剖镜观察解剖镜观察 形态特点、活动形态特点、活动 形态、活动形态、活动 鉴定鉴定 1/27/20237（2 2）压片法和注射墨汁或卡红法）压片

4、法和注射墨汁或卡红法 （3 3）乳酸酚透明法）乳酸酚透明法小小型型肠肠道道蠕蠕虫虫 透透明明 观观察察其其体体表和内部结构表和内部结构 虫种鉴定虫种鉴定带绦虫带绦虫孕节孕节 子宫子宫侧支数侧支数 虫种虫种鉴定鉴定 1/27/20238（二）湿涂片法：（二）湿涂片法：（最常用）（最常用）n优点：简便、快速优点：简便、快速n缺点：由于取材少，故检出率较低，缺点：由于取材少，故检出率较低，（但对蛔虫、姜片虫等检出效果好）（但对蛔虫、姜片虫等检出效果好）连续涂片三张，可提高检出率。连续涂片三张，可提高检出率。1/27/20239n方法方法1、生理盐水（、生理盐水（NS）直接涂片法直接涂片法用于检查：蠕

5、虫卵、原虫滋养体用于检查：蠕虫卵、原虫滋养体2、碘液染色法、碘液染色法用于检查：原虫包囊用于检查：原虫包囊n注意：涂片要用注意：涂片要用NS保持其形态保持其形态与活动能力与活动能力 等渗1/27/202310（三）浓集法（三）浓集法特点：与湿涂片法相反。特点：与湿涂片法相反。1、沉淀法：、沉淀法：n原理：虫卵比重原理：虫卵比重水（溶剂）水（溶剂）n方法：（方法：（1）自然沉淀法：最常用的）自然沉淀法：最常用的沉淀法沉淀法n适于检查：蠕虫卵适于检查：蠕虫卵比重较大的原虫包囊比重较大的原虫包囊(少数少数)1/27/202311注意：对于比重较小的钩虫卵和原虫注意：对于比重较小的钩虫卵和原虫包囊效果

6、不好。包囊效果不好。（2）其他：）其他：n离心沉淀法离心沉淀法n倒置沉淀法倒置沉淀法n醛醚沉淀法醛醚沉淀法n汞碘醛离心沉淀法汞碘醛离心沉淀法 上述方法，上述方法，各有特点各有特点1/27/2023122、浮聚法：、浮聚法：n原理：虫卵比重原理：虫卵比重（比重较大的）溶液（比重较大的）溶液n方法：（方法：（1）饱和盐水饱和盐水浮聚法：最常用浮聚法：最常用（比重：（比重：1.20）n适于检查：线虫卵适于检查：线虫卵(钩虫卵尤佳钩虫卵尤佳)带绦虫卵带绦虫卵微小膜壳绦虫卵微小膜壳绦虫卵n不适于查：吸虫卵不适于查：吸虫卵(比重比重1.2)原虫包囊原虫包囊1/27/202313（2）硫酸锌离心浮聚法）硫酸

7、锌离心浮聚法n操作：操作：n适于检查：适于检查：原虫包囊、卵囊原虫包囊、卵囊线虫卵线虫卵微小膜壳绦虫卵微小膜壳绦虫卵粪类圆线虫幼虫粪类圆线虫幼虫肝吸虫等部分吸虫卵肝吸虫等部分吸虫卵1/27/202314（四）幼虫孵化法（四）幼虫孵化法1、毛蚴孵化法：、毛蚴孵化法：用于用于血吸虫病血吸虫病诊断。诊断。n适用情况：适用情况：粪便直接涂片法或粪便直接涂片法或自然沉淀法检查阴性自然沉淀法检查阴性无显微镜时无显微镜时n方法：方法：30g粪便粪便滤去粗渣滤去粗渣沉淀沉淀沉沉渣渣孵孵化化近水面处是否有毛蚴活动？近水面处是否有毛蚴活动？去上清烧瓶，加“凉开水”2530 46小时观察1/27/2023152、钩

8、蚴培养法：、钩蚴培养法：用于用于钩虫病钩虫病的诊断的诊断n适用情况：适用情况：粪便镜检阴性粪便镜检阴性无显微镜时无显微镜时n操作方法：操作方法：n特点：检出率高，可作虫种鉴定特点：检出率高，可作虫种鉴定但费时较长（但费时较长（35天）天）且冬天需保温且冬天需保温 1/27/2023161/27/202317（五）特殊染色法五）特殊染色法1、主要用于原虫的鉴定：、主要用于原虫的鉴定：原虫小不经染色内部结构很难看清原虫小不经染色内部结构很难看清如：阿米巴如：阿米巴拟染色体、核拟染色体、核虫种区别虫种区别n染色方法：多染色方法：多2、蠕虫经普通方法难于鉴定时、蠕虫经普通方法难于鉴定时例：钩虫例：钩虫

9、美洲钩虫？美洲钩虫？十二指肠钩虫？十二指肠钩虫？铁苏木素染色1/27/202318二、定量诊断方法二、定量诊断方法n原理原理：定量粪便中定量粪便中虫卵数虫卵数n用途：估计寄生虫感染数量与程度用途：估计寄生虫感染数量与程度判断防治效果判断防治效果（虫多虫多卵多）卵多）（一）改良加藤法（一）改良加藤法（加藤厚涂片法）（加藤厚涂片法）n特点：简便、快捷，被特点：简便、快捷，被WHO认可认可n方法：取约方法：取约41.7mg粪便粪便厚粪膜厚粪膜透明透明镜检镜检（3036，30min）甘油孔雀绿溶液1/27/2023191/27/202320n适于：蠕虫卵检查适于：蠕虫卵检查n注意：注意：粪膜厚度适当粪

10、膜厚度适当透明时间适当透明时间适当（二）司徒耳氏（二）司徒耳氏(STOLLS)虫卵计数法虫卵计数法检查：检查：蠕虫卵蠕虫卵（三）小管浮聚法：（三）小管浮聚法：n主要用于钩虫卵计数主要用于钩虫卵计数n（定量诊断在感染度低时误差较大）（定量诊断在感染度低时误差较大）1/27/202321注意事项注意事项（准确性）1、粪便要新鲜粪便要新鲜(无污染无污染)，及早送检，及早送检2、送检的粪量要恰当送检的粪量要恰当n一般：一般：510gn自然沉淀法：自然沉淀法：30gn查带绦虫头节：查带绦虫头节：24h粪便粪便3、注意粪便的性状、颜色等，特别、注意粪便的性状、颜色等，特别注意有无粘液、脓液、血液等注意有无

11、粘液、脓液、血液等如：果酱样便如：果酱样便4、粪便中酵母菌、花粉等应注意与粪便中酵母菌、花粉等应注意与虫卵、原虫包囊等区别虫卵、原虫包囊等区别 1/27/202322n粪便要新鲜粪便要新鲜n份量要恰当份量要恰当n性状要观察性状要观察n杂物要区别杂物要区别 1/27/202323第二节第二节肛周检查肛周检查 一、虫卵检查一、虫卵检查n主要用于主要用于蛲虫病、带绦虫病蛲虫病、带绦虫病的诊断的诊断n方法：肛门拭子法方法：肛门拭子法1、透明胶纸法、透明胶纸法2、棉签拭子法、棉签拭子法n注意：蛲虫卵检查时间注意：蛲虫卵检查时间清晨便前清晨便前二、成虫检查二、成虫检查n诊断：诊断：蛲虫病蛲虫病n时间：晚间

12、，小孩熟睡后时间：晚间，小孩熟睡后（哭闹时）（哭闹时）1/27/2023241/27/202325第三节第三节血液及骨髓检查血液及骨髓检查在我国血液、骨髓内的寄生虫主要有：在我国血液、骨髓内的寄生虫主要有：疟原虫疟原虫、丝虫丝虫、杜氏利什曼原虫、杜氏利什曼原虫一、血中疟原虫检查一、血中疟原虫检查（一）采血（一）采血1、采血时间：、采血时间：nPv、Pm：发作后数小时发作后数小时十几小时十几小时nPf：发作后马上采血发作后马上采血 1/27/2023262、采血部位：、采血部位：n耳垂耳垂n指尖指尖（左手无名指为宜）（左手无名指为宜）n婴幼儿可于婴幼儿可于足跟足跟采血采血（二）涂片（二）涂片厚血

13、膜厚血膜：（需溶血）：（需溶血）用于流调用于流调薄血膜薄血膜：（不要溶血）用于临检：（不要溶血）用于临检各有特点，可结合运用各有特点，可结合运用 1/27/2023271/27/202328（三）染色：（三）染色：瑞氏染色瑞氏染色姬氏染色姬氏染色n特点特点：染色快速：染色快速染色费时较长染色费时较长血片易腿色血片易腿色染色效果稳定、色泽鲜明染色效果稳定、色泽鲜明不能长期保存不能长期保存可长期保存可长期保存n用于用于：临床检验：临床检验教学教学（四）镜检：（四）镜检：1、是否是疟原虫？、是否是疟原虫？(注意与注意与WBC、Pt等区别）等区别）2、是哪一种疟原虫？、是哪一种疟原虫？1/27/202

14、329二、血中微丝蚴（二、血中微丝蚴（mf）检查检查（一）厚血膜法：（一）厚血膜法：最常用最常用1、采血：、采血：（1）采血时间）采血时间W.b10PM2AMB.m8PM4AM（2）采血部位：指尖采血部位：指尖or耳垂耳垂（3）采血量：三大滴（）采血量：三大滴（60mm3）2、涂片：涂片：1.52.5cm2厚血膜厚血膜3、溶血：、溶血：1/27/2023304、染色：、染色：品蓝染色品蓝染色德氏苏木素染色德氏苏木素染色5、镜检：、镜检：是否是否mf？哪种哪种mf？（二）微孔薄膜过滤浓集法：二）微孔薄膜过滤浓集法：用于血中用于血中mf密度较低者效果更好密度较低者效果更好（三）海群生白天诱出法（三

15、）海群生白天诱出法用于夜间无法采血者用于夜间无法采血者 1/27/202331三、骨髓中查杜氏利什曼原虫三、骨髓中查杜氏利什曼原虫黑热病诊断黑热病诊断髂骨穿刺法：常用髂骨穿刺法：常用特点：安全、可靠特点：安全、可靠骨髓涂片骨髓涂片镜检镜检（M中：无鞭毛体）中：无鞭毛体）利杜体利杜体 瑞氏or姬氏染色1/27/202332第四节第四节排泄物及分泌物检查排泄物及分泌物检查一、痰液一、痰液n可能查见：可能查见：肺吸虫卵肺吸虫卵细粒棘球绦虫原头节细粒棘球绦虫原头节蛔蚴、钩蚴蛔蚴、钩蚴粪类圆线虫幼虫粪类圆线虫幼虫痢疾阿米巴大滋养体痢疾阿米巴大滋养体卡氏肺孢子虫包囊卡氏肺孢子虫包囊尘螨、粉螨尘螨、粉螨n注

16、意：早上起床后，用力咳出气管深部注意：早上起床后，用力咳出气管深部的痰液（晨痰）的痰液（晨痰）1/27/202333（一）肺吸虫卵检查（一）肺吸虫卵检查：（除原虫均可用）（除原虫均可用）1、直接涂片法：简便、直接涂片法：简便2、浓集法：（可、浓集法：（可检出率）检出率）方法：方法：24h痰液痰液消化数小时消化数小时离心离心10min镜检沉渣镜检沉渣（二）卡氏肺孢子虫包囊检查（二）卡氏肺孢子虫包囊检查方法：痰液涂片方法：痰液涂片姬氏染色姬氏染色镜检镜检510%NaOH1/27/202334二、尿液二、尿液检查：丝虫检查：丝虫mf、阴道毛滴虫等阴道毛滴虫等埃及血吸虫埃及血吸虫（来自非洲或中东者）（

17、来自非洲或中东者）方法：取尿液方法：取尿液35ml离心离心镜检沉渣镜检沉渣三、阴道分泌物三、阴道分泌物检查：阴道毛滴虫检查：阴道毛滴虫方法：方法：NS直接涂片法直接涂片法1/27/202335四、十二指肠引流液四、十二指肠引流液十二指肠引流液包括：十二指肠液十二指肠引流液包括：十二指肠液胆总管液胆总管液胆囊液胆囊液肝胆管液肝胆管液用于诊断：贾第虫病、华支睾吸虫病用于诊断：贾第虫病、华支睾吸虫病胆道蛔虫病、姜片虫病胆道蛔虫病、姜片虫病肝片吸虫病、粪类圆线虫肝片吸虫病、粪类圆线虫本法常在临床症状可疑、多次粪检本法常在临床症状可疑、多次粪检阴性时（需排除肿瘤时）使用阴性时（需排除肿瘤时）使用 1/2

18、7/202336五、脑脊液（五、脑脊液（csf）可查见可查见弓形虫、锥虫弓形虫、锥虫痢疾阿米巴痢疾阿米巴棘球蚴的原头节棘球蚴的原头节肺吸虫、血吸虫卵肺吸虫、血吸虫卵广州管圆线虫（幼虫）广州管圆线虫（幼虫）方法：方法：csf（23ml）离心离心镜检沉渣（镜检沉渣（or染色后镜检染色后镜检）1/27/202337六、浆膜腔积液六、浆膜腔积液（一）胸、腹腔积液（取（一）胸、腹腔积液（取510ml）可查见：弓形虫、丝虫可查见：弓形虫、丝虫mf、肺吸虫卵、棘球蚴等肺吸虫卵、棘球蚴等（二）鞘膜积液（二）鞘膜积液可查见：班氏可查见：班氏mf 1/27/202338第五节第五节活活检检一、皮肤一、皮肤（一）皮

19、下包块与结节（一）皮下包块与结节1、囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫等、囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫等包块手术包块手术检获虫体检获虫体鉴定鉴定2、皮肤型利什曼病：、皮肤型利什曼病：活检病变组织活检病变组织涂片涂片切片切片染色染色镜检镜检 1/27/202339（二）疥螨（二）疥螨：检查皮损：检查皮损捉虫捉虫方法方法针挑法针挑法刀刮法刀刮法（三）蠕形螨（三）蠕形螨透明胶纸粘贴法：常用透明胶纸粘贴法：常用（四）蝇蛆（四）蝇蛆：皮肤蝇蛆症：皮肤蝇蛆症 1/27/202340二、肌肉二、肌肉（一）囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫（一）囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫检查方法检查方法:同上同上（二）旋毛虫幼虫（二）旋毛虫幼虫疼痛肌

20、肉疼痛肌肉（腓肠肌（腓肠肌or二头肌）二头肌）压片压片镜检（囊包）镜检（囊包）1/27/202341三、淋巴结三、淋巴结n用于检查：丝虫用于检查：丝虫杜氏利什曼原虫杜氏利什曼原虫弓形虫弓形虫n方法：方法：1、穿刺法、穿刺法2、摘除法、摘除法 1/27/202342四、直肠粘膜四、直肠粘膜（一）血吸虫卵（一）血吸虫卵1、问题：粘膜中发现虫卵能否确诊？、问题：粘膜中发现虫卵能否确诊？为什么？为什么？2、虫卵死活鉴别、虫卵死活鉴别方法方法非染色法非染色法染色法染色法3、意义：诊断与疗效考核、意义：诊断与疗效考核（二）痢疾阿米巴大滋养体（二）痢疾阿米巴大滋养体病变组织的活检物病变组织的活检物镜检镜检o

21、r刮拭物刮拭物1/27/202343五、肝五、肝可查见：痢疾阿米巴可查见：痢疾阿米巴血吸虫卵血吸虫卵利什曼原虫等利什曼原虫等 1/27/202344第六节第六节人工培养人工培养1、原理：、原理：阿米巴、利什曼原虫等阿米巴、利什曼原虫等培养培养增加其数量增加其数量检查培养物检查培养物诊断诊断2、特点：、特点：方法复杂方法复杂条件要求高条件要求高费时长费时长因此，临床很少使用因此，临床很少使用1/27/202345第七节第七节动物接种与病原分离动物接种与病原分离病理组织或分泌物病理组织或分泌物接种接种(感染感染)动物动物盲传几次盲传几次病原体生长繁殖病原体生长繁殖数量增加数量增加解剖动物检查解剖动

22、物检查诊断：弓形虫、利什曼原虫等诊断：弓形虫、利什曼原虫等临床很少用：原因同上临床很少用：原因同上 1/27/202346II免疫学诊断免疫学诊断n可弥补病原学诊断的不足，因此被可弥补病原学诊断的不足，因此被广泛应用。是寄生虫病重要诊断方法。广泛应用。是寄生虫病重要诊断方法。n一、原理一、原理：寄生虫侵入人体，其本身及代谢产物寄生虫侵入人体，其本身及代谢产物对人体均是抗原（对人体均是抗原（Ag），），因此，人体因此，人体将产生相应的抗体（将产生相应的抗体（Ab）,故可通过故可通过免疫学方法检测寄生虫的特异性免疫学方法检测寄生虫的特异性Ag或或Ab来来进行寄生虫病诊断。进行寄生虫病诊断。1/27

23、/202347n二、诊断价值：二、诊断价值：1、可用于寄生虫病的辅助辅助诊断或排除排除某些寄生虫感染。2、检测寄生虫的特异性抗原抗原或对其Ab滴度滴度进行动态观察动态观察结合临床可确诊寄生虫病。1/27/202348第一节第一节方法与技术方法与技术体液免疫检测技术体液免疫检测技术包括包括细胞免疫检测技术细胞免疫检测技术一、寄生虫抗原的种类一、寄生虫抗原的种类n整体寄生虫抗原整体寄生虫抗原n排泄分泌抗原排泄分泌抗原n寄生虫粗抗原寄生虫粗抗原n纯化抗原纯化抗原n固相抗原固相抗原 检测Ab检测Ag1/27/202349二、被检测的寄生虫抗体二、被检测的寄生虫抗体IgM是是出现最早、持续时间较短的抗体

24、出现最早、持续时间较短的抗体检测特异性检测特异性IgM具有早期诊断价值具有早期诊断价值IgG是是水平高、持续时间长的抗体水平高、持续时间长的抗体特异性特异性IgG是诊断的主要目的抗体是诊断的主要目的抗体抗体水平与感染度及病程呈正相关抗体水平与感染度及病程呈正相关IgE与与IgA1/27/202350三、方法三、方法（多，只简介）（多，只简介）(一一)皮内试验：皮内试验：（类似青霉素皮试）（类似青霉素皮试）(某某)寄生虫寄生虫Ag 皮内皮内皮肤反皮肤反应应特点：简便特点：简便快速快速但多交叉反应但多交叉反应用途：临床辅助诊断用途：临床辅助诊断流行病学调查时初筛流行病学调查时初筛 注入观察1/27

25、/202351(二二)血清学检查血清学检查取材：血清、取材：血清、Csf、尿等尿等1、沉淀试验、沉淀试验原理：原理：AgAb结合结合产生产生沉淀物沉淀物举例：环卵沉淀试验举例：环卵沉淀试验血吸虫病血吸虫病诊断诊断双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验2、染色试验、染色试验用于用于弓形虫病弓形虫病诊断诊断1/27/2023523、凝集试验、凝集试验原理：原理：寄生虫寄生虫Ag血清中相应血清中相应Ab结合结合载体载体(RBC)表面表面结合结合AgAb特异反应特异反应间接表现间接表现 红细胞凝集红细胞凝集 1/27/202353n优点优点：操作简便、价格低廉操作简便、价格低廉敏感性与特异性均较好敏感性与特

26、异性均较好n常用方法常用方法：间接间接RBC凝集试验凝集试验胶乳凝集试验胶乳凝集试验1/27/2023544、免疫标记技术、免疫标记技术n原理：原理：标标记记物物 标记标记 已知已知Ag已知已知Ab测定测定未知未知Ab未知未知Ag检测标记物检测标记物诊断寄生虫病诊断寄生虫病n特点特点：敏感性高：敏感性高特异性亦好特异性亦好为目前最为理想的免疫学诊断技术，应用广泛。为目前最为理想的免疫学诊断技术，应用广泛。1/27/202355n种类：根据标记物不同，常用的有种类：根据标记物不同，常用的有荧光素荧光素(免疫标记技术免疫标记技术)酶酶同位素同位素胶体金胶体金酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELI

27、SA)应用最为广泛。目前，国内外已开发应用最为广泛。目前，国内外已开发出多种寄生虫病快速出多种寄生虫病快速ELISA诊断试剂诊断试剂盒用于临床。盒用于临床。1/27/202356第二节第二节应应用用一、临床应用免疫诊断的一般前提一、临床应用免疫诊断的一般前提：1.无无“离体阶段离体阶段”旋毛虫、囊虫病旋毛虫、囊虫病各种幼虫移行症各种幼虫移行症2.高度怀疑，但（由于各种原因）找不到离体高度怀疑，但（由于各种原因）找不到离体阶段：阶段：轻度感染轻度感染早期感染：卫氏并殖吸虫等早期感染：卫氏并殖吸虫等慢性和晚期感染：血吸虫、丝虫慢性和晚期感染：血吸虫、丝虫异位寄生：血吸虫等异位寄生：血吸虫等深部组织

28、寄生：肠外阿米巴病深部组织寄生：肠外阿米巴病 1/27/2023573、提示性或排除性诊断、提示性或排除性诊断：例如：颅内占位性病变例如：颅内占位性病变痢疾阿米巴痢疾阿米巴血吸虫血吸虫寄生虫寄生虫肺吸虫肺吸虫囊虫囊虫 棘球蚴棘球蚴肿瘤、肿瘤、原因1/27/202358二、优点：二、优点：敏感性高敏感性高方便方便易于进行大批量自动化检测易于进行大批量自动化检测特异性较好、快速和无损伤性特异性较好、快速和无损伤性三、免疫学诊断的局限性三、免疫学诊断的局限性（一）假阳性和交叉反应（一）假阳性和交叉反应（二）假阴性（二）假阴性（三）试剂的标准化（三）试剂的标准化（四）结果判断的人为因素影响（四）结果判

29、断的人为因素影响 1/27/202359四、免疫学检测结果的判断与处理四、免疫学检测结果的判断与处理（一）与流行病学和临床资料相结合（一）与流行病学和临床资料相结合（二）参考免疫反应的滴度（二）参考免疫反应的滴度（三）考虑实验中的各种影响因素（三）考虑实验中的各种影响因素（四）进行动态检测和重复检测（四）进行动态检测和重复检测（五）参考文献和咨询寄生虫学专家（五）参考文献和咨询寄生虫学专家（六）诊断性治疗（六）诊断性治疗 1/27/202360III核酸核酸(基因基因)诊断技诊断技术术一一、概概述述：它它是是近近年年来来迅迅速速发发展展起起来来的的一一门门新新的的诊诊断断技技术术，在在寄寄生生

30、虫虫病病诊诊断断和和研研究究中中应应用用越越来来越越广广泛泛。人人们们预预言言，21世世纪纪将将是是分分子子生生物物学学世世纪纪，因因此此，本本技技术术将将是是寄寄生生虫虫诊诊断技术的一个发展方向。断技术的一个发展方向。1/27/202361二、原理二、原理：检测寄生虫特异的检测寄生虫特异的DNA诊断诊断寄生虫病寄生虫病三、特点三、特点：优点：敏感性高优点：敏感性高（ng、pg级）级）（Example:Pool-Blood）特异性强特异性强且有确诊价值。且有确诊价值。缺点：费用较昂贵缺点：费用较昂贵检测条件要求较高。检测条件要求较高。1/27/202362四、方法四、方法：1、PCR法法（聚合

31、酶链反应）（聚合酶链反应）原理：寄生虫某一特异原理：寄生虫某一特异DNA序列序列PCR PCR 大量扩增大量扩增检测检测诊断诊断（目前已开发出许多关于遗传病、性病、传染（目前已开发出许多关于遗传病、性病、传染病、寄生虫病的病、寄生虫病的PCR诊断试剂盒用于临床）诊断试剂盒用于临床）1/27/2023632、核酸探针、核酸探针原理：标记特异核酸片段原理：标记特异核酸片段杂交杂交 探查探查其对应的互补序列其对应的互补序列诊断诊断 1/27/202364五、应用五、应用：目前主要用于下列寄生虫病的诊断：目前主要用于下列寄生虫病的诊断：n利什曼病利什曼病n疟疟疾疾n弓形虫病弓形虫病n肺孢子虫病肺孢子虫

32、病n锥锥虫虫n丝虫病丝虫病n恙虫病恙虫病 1/27/202365寄生虫标本的固定和保存寄生虫标本的固定和保存概述概述意意义义：通通过过防防止止寄寄生生虫虫虫虫体体发发生生细细胞胞自自溶溶、腐腐败败、变变质质或或组组织织干干缩缩等等破破坏坏，便便于于标标本本的的长长久久保保存存，以以满满足足诊诊断断或或科学研究需要的技术。科学研究需要的技术。1/27/202366（一）固定与保存的一般要求：（一）固定与保存的一般要求：1、标本越新鲜越好、标本越新鲜越好2、根据标本选择相应的固定和保存方法、根据标本选择相应的固定和保存方法3、记录标本的采集时间、地点及患者、记录标本的采集时间、地点及患者姓名姓名1

33、/27/202367（二）常用固定液（二）常用固定液1、福尔马林：常用浓度为、福尔马林：常用浓度为510%的甲醛溶液的甲醛溶液2、酒精：常用浓度为、酒精：常用浓度为7075%3、其他：甲醇、乙酸、肖氏液、其他：甲醇、乙酸、肖氏液氯化汞、聚乙烯醇等氯化汞、聚乙烯醇等 1/27/202368固定与保存方法固定与保存方法原虫的固定与保存原虫的固定与保存一、玻片法：一、玻片法：（一）腔道原虫：（一）腔道原虫：粪便粪便or分泌物分泌物涂片涂片40的肖氏液的肖氏液5min碘酒脱汞碘酒脱汞70%酒精中保存酒精中保存（二）组织（二）组织or血液原虫：血液原虫：组织液组织液or血液血液涂片涂片甲醇固定甲醇固定染

34、色染色 立即置于1/27/202369二、液浸法：二、液浸法：用于用于原虫包囊原虫包囊的保存的保存粪便粪便+5%福尔马林福尔马林混悬液混悬液经经6080目铜筛过滤目铜筛过滤滤液沉淀滤液沉淀34h弃上清弃上清加加5%福尔马林保存福尔马林保存 1/27/202370三、低温法三、低温法（一）（一）4冰箱：时间不宜超过冰箱：时间不宜超过4h（二）液氮保存：二）液氮保存：1、保存时间较长、保存时间较长2、保持原虫生物学活性、保持原虫生物学活性1/27/202371蠕虫的固定与保存蠕虫的固定与保存基本过程：基本过程：洗涤洗涤（伸展）（伸展）固定保存固定保存一、线虫：一、线虫：大型线虫大型线虫小型线虫小型

35、线虫（蛔、鞭）（蛔、鞭）（钩、蛲）（钩、蛲）生理盐水洗涤生理盐水洗涤70708080 加热加热 70%酒精固定酒精固定甘油酒精固定甘油酒精固定于于70%酒精中保存酒精中保存 1/27/202372二、吸虫二、吸虫大型吸虫大型吸虫小型吸虫小型吸虫生理盐水洗涤生理盐水洗涤薄菏脑酒精薄菏脑酒精(伸展伸展)玻片压平玻片压平10%甲醛固定甲醛固定24h5%甲醛中保存甲醛中保存 1/27/202373三、绦虫三、绦虫大型绦虫大型绦虫小型绦虫小型绦虫清水洗涤数次清水洗涤数次NS洗涤洗涤4,NS浸泡过夜浸泡过夜3%福尔马林固定福尔马林固定35h3%福尔马林固定福尔马林固定24h5%福尔马林保存福尔马林保存 1

36、/27/202374四、蠕虫卵四、蠕虫卵水洗沉淀虫卵水洗沉淀虫卵去上清去上清沉渣加入等量沉渣加入等量10%福尔马林固定保存福尔马林固定保存（如虫卵内为卵细胞（如虫卵内为卵细胞or受精蛔虫卵，则需将受精蛔虫卵，则需将固定液加热至固定液加热至70。）。）1/27/202375昆虫的固定与保存昆虫的固定与保存1、干标本保存、干标本保存：（针插法）（针插法）用途：保存有翅昆虫成虫用途：保存有翅昆虫成虫方法：方法：（昆虫针）（昆虫针）针插虫体针插虫体插于插于昆虫盒软木板昆虫盒软木板旁置旁置or玻璃管软木塞玻璃管软木塞樟脑 1/27/2023762、湿标本保存、湿标本保存：（液浸法）用途用途：保存无翅昆虫及保存无翅昆虫及有翅昆虫的卵和幼虫期有翅昆虫的卵和幼虫期处理方法：处理方法：昆昆虫虫70%酒精酒精（60607070）固定一天固定一天保存于保存于5%甘油酒精中甘油酒精中 1/27/202377