细胞培养 (3).ppt

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1、细胞培养细胞培养理论课：理论课：第一部分第一部分细胞培养基本知识细胞培养基本知识李李松松第二部分第二部分细胞培养室的设置、细胞培养用液细胞培养室的设置、细胞培养用液李李松松第三部分第三部分细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术卿卿晨晨博士博士第四部分第四部分正常组织细胞的培养正常组织细胞的培养李李松松第五部分第五部分肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养杨继红杨继红博士博士第六部分第六部分组织培养技术和应用组织培养技术和应用卿卿晨晨博士博士杨继红杨继红博士博士实验部分：参观实验室实验部分：参观实验室培养细胞的观察培养细胞的观察培养细胞生长曲线的绘制培养细胞生长曲线的绘制 第一章第一章细胞培养基本知识细胞培养基

2、本知识组织培养工作始于本世纪之初（组织培养工作始于本世纪之初（Harrison1907,Carrel1912）组织培养、细胞培养、器官培养组织培养、细胞培养、器官培养组织细胞培养的主要优点：组织细胞培养的主要优点：（1 1）研究的对象是活的细胞；研究的对象是活的细胞；（2 2）研究的条件可控制；研究的条件可控制；（3 3）研究的样本可以达到均一性；研究的样本可以达到均一性；（4 4）研究的内容便于观察、检测；研究的内容便于观察、检测；（5 5）研究的范围比较广泛；研究的范围比较广泛；（6 6）研究的费用相对较经济。研究的费用相对较经济。细胞培养存在的不足：细胞培养存在的不足：（1）组织或细胞与

3、体内相应者仍然存在差异；组织或细胞与体内相应者仍然存在差异；（2）细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一；细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一；（3）细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。研究的内容：研究的内容：（1）细胞与细胞之间的相互作用。细胞与细胞之间的相互作用。（2）细胞内部与细胞外界之间的作用。细胞内部与细胞外界之间的作用。（3）细胞内胞质的活动。细胞内胞质的活动。（4）胞质与胞核之间流动。胞质与胞核之间流动。应用领域：应用领域：1病毒学病毒学利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。2免疫

4、学免疫学杂交瘤一单克隆抗体技术。杂交瘤一单克隆抗体技术。3遗传学遗传学可以利用细胞培养技术进行染色体分析。细胞遗传学。可以利用细胞培养技术进行染色体分析。细胞遗传学。4肿瘤学肿瘤学细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗。细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗。5分化及发育分化及发育6细胞毒试验细胞毒试验7临床医学及生物技术方面的应用临床医学及生物技术方面的应用一、培养细胞的特性一、培养细胞的特性（一）、培养细胞的生长方式及类型（一）、培养细胞的生长方式及类型1贴附生长型细胞：贴附生长型细胞：上皮细胞型：上皮细胞型：其生长特点为细胞之间紧密相靠、其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，具有连

5、接成片能力。互相衔接，具有连接成片能力。成纤维细胞型：其生长特点为细胞一般并不紧靠相成纤维细胞型：其生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为漩涡状、放射状。连成片，而是排列为漩涡状、放射状。2.悬浮生长型细胞：不需要附着于底物即可生长，肿悬浮生长型细胞：不需要附着于底物即可生长，肿瘤细胞及部分正常细胞瘤细胞及部分正常细胞（二）、培养细胞的生长特点二）、培养细胞的生长特点1贴附贴附细胞接种后细胞接种后510min可见细胞以伪足初期附着，接着可见细胞以伪足初期附着，接着细胞逐渐伸展开，细胞体的中心部分亦随之变为扁平。细胞逐渐伸展开，细胞体的中心部分亦随之变为扁平。2接触抑制及密度依赖性接触抑

6、制及密度依赖性细细胞胞生生长长汇汇合合成成一一片片时时，其其分分裂裂增增殖殖停停止止，这这种种生生长特性即为密度依赖性调节。长特性即为密度依赖性调节。转转化化细细胞胞或或癌癌瘤瘤细细胞胞则则接接触触抑抑制制下下降降，他他们们互互相相之之间可在上面或下面经过而重叠生长。间可在上面或下面经过而重叠生长。（三）、培养细胞的生长过程（三）、培养细胞的生长过程1单个细胞的生长过程：细胞周期单个细胞的生长过程：细胞周期细胞周期细胞周期=间期间期+M期期=G1期期+S期期+G2期期+M期期G1期：期：DNA合成前期，为下一步合成前期，为下一步DNA复制和蛋白质合成复制和蛋白质合成作准备。作准备。S期：期：D

7、NA合成期。本期的细胞活动主要为合成期。本期的细胞活动主要为DNA的合成。的合成。G2期：期：DNA合成后期。合成后期。M期：有丝分裂期。期：有丝分裂期。2细胞系（细胞系（cellline）的生长过程：的生长过程：原代培养（原代培养（primaryculture）：）：传代期（传代期（subculture）：）：衰退期：衰退期：3每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程滞留期：一般细胞滞留期约为滞留期：一般细胞滞留期约为2496h。指数生长期：此期细胞增殖旺盛，成倍增长，适用于指数生长期：此期细胞增殖旺盛，成倍增长，适用于进行实验研究。持续进行实验研究。持续35d。平台期：平台期：二、培养细胞生长

8、的条件二、培养细胞生长的条件（一）、细胞的营养需要（一）、细胞的营养需要1基本营养物质基本营养物质:包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子。包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子。2促生长因子：血清中含有多种上述细胞生长所需的物促生长因子：血清中含有多种上述细胞生长所需的物质。质。3其它条件其它条件:温度：温度：需在保持一定恒温，适宜的温度与取材的动物种类有关。高温比低温对细胞的影响细胞更为明显。气相：气相：多数细胞需要有O2条件下才能生长，氧张力通常维持在略低于大气状态，体外培养细胞其气体环境一般应为95%空气加CO2的混合气体。pH：适于在pH7.27.4条件下生长，一般来说，偏酸的条

9、件比偏碱的环境对生长有利。渗透压：渗透压：人类血浆的渗透压约为290mmol/L，多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力。无污染及无毒：无污染及无毒：微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染。第二章第二章 细胞培养室的设置和准备工细胞培养室的设置和准备工作作一、细胞培养实验室的设置及设备一、细胞培养实验室的设置及设备（一）、（一）、细胞培养实验室的设置细胞培养实验室的设置 细胞培养实验室应能进行：无菌操作、孵育、细胞培养实验室应能进行：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。1无菌操作区无菌操作区（1）无菌操作室）无菌操作室（2）净化工作台）净化工作台 侧

10、流式或称为垂直式；外流式侧流式或称为垂直式；外流式或称为水平层流式。或称为水平层流式。（3）无菌操作箱）无菌操作箱2孵育区孵育区3制备区：进行培养液及有关培养用液等的制备。制备区：进行培养液及有关培养用液等的制备。4储藏区储藏区5清洗和消毒灭菌区清洗和消毒灭菌区（二）、细胞培养实验室设备（二）、细胞培养实验室设备 1常用的基本设备常用的基本设备（1）显微镜：）显微镜：倒置显微镜（2）培养箱：）培养箱：恒温培养箱及CO2培养箱（3）干燥箱：）干燥箱：（4）水纯化装置：）水纯化装置：培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水。（5）冰箱：）冰箱：（6）细胞冷冻储存器：）细胞冷冻储存器：（7）离心机：）离心机

11、：（8）消毒器：）消毒器：（9）滤器：）滤器：（10）各类培养用器皿：）各类培养用器皿：培养器皿、培养瓶、多孔培养板、吸管、加样器等。2特殊设备特殊设备:酶联免疫检测仪、超低温冰箱、流式细胞仪等。二、培养用品的清洗和消毒灭菌二、培养用品的清洗和消毒灭菌（一）、培养用品的清洗（一）、培养用品的清洗 1清洗清洗（1）浸泡：）浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡过夜，以中和其碱性物质。（2）刷洗：）刷洗：（3）清洁液浸泡：）清洁液浸泡：由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，浸泡6h以上。2.冲洗冲洗 （二）、培养用品的消毒灭菌（二）、培养用品的消毒灭菌 1消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法（1）干热消毒）干热消毒（

12、2）湿热消毒）湿热消毒（3）紫外线消毒：）紫外线消毒：（4）过滤除菌消毒：）过滤除菌消毒：血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。微孔滤膜滤器：微孔滤膜滤器：有孔径为0.6m、0.45m、0.22m 三种滤膜，注意滤膜的正面（光面）应向上。（5）消毒剂及抗菌素：）消毒剂及抗菌素：抗菌素的应用是为了预防，不能依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素及链霉素。2消毒方法的选择消毒方法的选择 实验室中空气的消毒，过滤、紫外线消毒、电子灭菌灯。实验室的消毒，最常用的是以酒精擦拭，亦可以紫外线照射。培养器械的消毒：干热或湿热消毒、消毒剂浸泡或紫外线照射。培养用液体的消毒：高压蒸汽消毒

13、、过滤方法除菌。第三章第三章 细胞培养用液及培养基细胞培养用液及培养基一、培养用液一、培养用液 1水水 水为细胞培养所必需，在组织细胞培养中用水必须非常纯。2平衡盐溶液平衡盐溶液 维持渗透压、调节pH值，供给细胞所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基（液）的基础液及用于洗涤组织、细胞等。平衡盐溶液主要以无机盐及葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液的主要不同点在于氯化纳的浓度、离子的浓度及缓冲系统不同。3消化液消化液 （1）胰蛋白酶液：）胰蛋白酶液：常用浓度为0.25%，配制时应用不含Ca2+、Mg2+和含血清的液体。（2）EDTA（二乙烯四乙酸二钠）液：二乙烯四乙酸二钠）液：EDTA是一种化学

14、螯合剂，主要作用在于能吸取Ca2+、Mg2+，使细胞分离，常用浓度为0.02%，用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解。（3）胶原酶：）胶原酶：二、二、培养基培养基（一）、天然培养基（一）、天然培养基 1血清血清 小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，血清虽是常用的天然培养基，对绝大多数细胞的生长有利，某些成份可能对细胞有害。2血浆血浆 3组织浸出液组织浸出液 4水解乳蛋白水解乳蛋白（二）、合成培养基（二）、合成培养基 合成培养基给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境。1合成培养基基本成分合成培养基基本成分氨基酸：氨基酸：以必需氨基酸为主，细胞仅能利用氨基酸的

15、L型同分异构体。细胞对谷氨酰胺之有较高的要求。维生素：维生素：糖类：糖类：培养基中的碳水化合物包括葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠等。无机离子：无机离子：培养基含有平衡盐液中的钾、钠等无机盐，有些培养基含有微量元素，如Fe2+、Zn2+、Ca2+等。其它成分：其它成分：三磷酸腺苷、辅酶A、2-硫基乙醇、植物血凝素等。2 常用的合成培养基常用的合成培养基 （1）199培养液：培养液：是Morgan、Morton及Parker等人在1950年为培养鸡胚细胞研制的。（2）Eagle培养液培养液：由Parker首先备制，Eagle等根据胞质内的氨基酸及维生素的含量比基本培养液中大15倍，配制了最低必需

16、培养液（Eagles minimum essential medium,MEM）。又改良研究制成了BME（Basal Eagle Medium）和DMEM（Dulbecco MEM）。（3）RPMI 1640培养液：由Moor等研究成功，不仅肿瘤细胞而且很多正常组织细胞可用。（4）Ham培养液：Ham首先备制，将其命名为F7，后改良为F10，F12培养基，这种培养基特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。3无血清培养基无血清培养基基础培养液：基础培养液：以HamF12和DMEM最为常用。辅加成分：辅加成分：（1）培养基质：）培养基质：主要目的是帮助细胞附着贴壁。常用的培养基质有：纤维连结素（fib

17、ronectin）、多聚赖氨酸（poly-lysine）、胶原。（2）营养成分：）营养成分：主要目的是补加各种不同细胞生长所需以及已知血清中促进细胞生长的物质。（3）酶抑制剂：）酶抑制剂：目的是替代血清的保护作用。第四部分第四部分 正常组织细胞的培养正常组织细胞的培养 不同组织细胞和器官的结构功能、生长特性不同，在体外培养中所需要的分离方法和生长条件也不同。一、上皮细胞的培养一、上皮细胞的培养 许多器官的上皮细胞具有特定的功能。上皮细胞在体外培养中需要从表皮分离、培养液和基质选择、增加适当的生长因子。（一）、表皮细胞（一）、表皮细胞 表皮细胞生长在胶原基膜上，并从基膜获取生长分化所需要的物质。

18、在体外培养情况下，可用胰蛋白酶消化法使表皮与真皮分开。原代或有限表皮细胞需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。在正常Ca2+浓度情况下可形成分化的复层生长细胞，在低Ca2+浓度下，则呈未分化单层细胞生长；有充足滋养细胞时，有助于减少混杂的成纤维细胞。1用品用品（1）培养液）培养液（1）含有4倍浓缩维生素及氨基酸的Eagles MEM，加有热灭活的15%FCS。（2）与上相同的4MEM，加无Ca2+的HBSS，用CaCL2调整Ca2+浓度为0.08m mol/L，用于人表皮细胞时则为0.22m mol/L。（3）FAD培养液，其组成为1份F12和3份DMEM，并加入腺嘌呤（1.8

19、104mol/L），霍乱毒素（1010mol/L），EGF（10ng/ml），氢化考的松（0.4g/ml）和5%FCS。（4）成品上皮细胞培养液：角化上皮细胞的KGM，适用于一般表皮细胞的EGM。2方法方法 在X线照射过的3T3细胞滋养层上也可以生长。为了模拟体内生长情况，已建立了一种“器官式培养系统”，即将细胞接种在胶原凝胶体上或者真皮上，培养的细胞可显示体内生长时的某些特点及分化状态。或将表皮细胞悬液或整个的培养物移植于体内，使表皮细胞生长受到间质的影响，表皮细胞表现出体内生长的特点。3鉴定鉴定 表皮细胞对角蛋白特异性单克隆抗体（CK）反应阳性，间充质细胞对波型丝特异性单克隆抗体（vime

20、tin）反应阳性。（二）、乳腺上皮细胞（二）、乳腺上皮细胞 乳腺上皮细胞来源于乳汁中，或乳房成形成术时。人胚胎小肠纤维细胞滋养层可抑制间质细胞生长。胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、EGF等可促进上皮细胞生长。用品：用品：（1）人血清（HuS）（2）储存液：胰岛素1mg/ml，溶于6m mol/L HCL 氢化可的松0.5mg/ml，溶于生理盐水 霍乱毒素，50g/ml，溶于生理盐水（3）消化液（TEGPE）：0.5%EDTA 10ml，溶于PBSA 0.2%EDTA 4ml，溶于PBSA 0.2%胰蛋白酶 4ml，溶于HBSS 1.0%胰蛋白酶 2ml，溶于HBSS（4）培养液：RPMI 164

21、0，15%FCS，10%HuS，霍乱毒素50ng/ml，氢化可的松0.5g/ml，胰岛素1g/ml。（三）、子宫颈（三）、子宫颈 子宫颈上皮细胞在细胞分化、癌前病变及癌的研究中有重要意义。原代培养易污染。可用组织块法进行原代培养，传代培养需要经照射过的3T3细胞作滋养层，培养液中需适当的添加物。（四）、肝（四）、肝 肝实质由大量肝细胞为主组成，含间质量少。用组织块法和原位灌注消化法均易获得肝细胞用于原代培养。肝实质细胞培养在游离漂浮的胶原薄片上细胞能较好表达其功能，预先在培养皿底铺一层胶原凝胶，把细胞接种在凝胶上。（五）、胰（五）、胰 将胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液之上，

22、经过3次离心分离，收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集，接种于涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。用品：用品：（1）摇动式培养箱（2）锥形瓶，容积25ml，经硅化处理（3）尼龙筛，孔径25m和40m；透析袋、5ml或10ml吸管、胶原涂布的培养皿（4）HBSS、无Ca2+、Mg2+、HBSS(HBSSDVC)（5）F12组织培养液，加20%小牛血清（6）I型胶原酶：（7）0.25%胰蛋白酶，溶于柠檬酸盐缓冲液，每升含柠檬酸三钠3g，NaCL 6g，葡萄糖5g，用NaOH调pH至7.6（8）牛血清白蛋白（BSA）结果：结果：其中3040%可判断为腺细胞，在光学和相差显微镜下都可观察到

23、酶原小滴。如果用已照射过的肺纤维细胞作为滋养层，细胞的3HTdR掺入及存活期均可明显增加。（六）、肾（六）、肾 从基质中可以分离出肾小管细胞，因为这些细胞含有D氨基酸氧化酶，能够在D缬氨酸中生长，基质细胞则不可，用胶原酶消化切碎的肾脏组织10h左右，再用吸管吹打则可获得肾小管及肾小球上皮细胞。（七）、气管及支气管上皮（七）、气管及支气管上皮 有血清存在。气管上皮细胞停止分裂，不会终分化。在无血清培养液中接种气管组织碎块，可以促进气管细胞生长，并抑制成纤维细胞生长。二、中胚层细胞的培养二、中胚层细胞的培养（一）、结缔组织细胞（一）、结缔组织细胞 在细胞培养中结缔组织细胞最容易生长，不需要特殊条件

24、。统称为成纤维细胞。成纤维细胞系中3T3系，成纤维细胞可分泌I和型胶原，大量分泌I型胶原则是结缔组织细胞的特点。结缔组织细胞可向多个方向分化。可采用组织块法培养。（二）、脂肪组织细胞（二）、脂肪组织细胞脂肪组织细胞中很难培养出脂肪细胞。成纤维细胞可被诱导分化出脂肪细胞，血清中的脂肪形成因子可能具有诱导作用。（三）、肌肉组织细胞（三）、肌肉组织细胞骨骼肌、心肌、平滑肌细胞均可在体外培养中生长，心肌细胞在培养中还具有自动节律性收缩功能，传代培养后可能逐渐丧失这种功能。平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或胶原酶消化法从血管壁、气管壁及肠壁等获得.（四）、软骨细胞（四）、软骨细胞软骨分为生长部和休止部，休止部软

25、骨细胞表现为终末分化细胞的特性，无形成软骨基质的能力。生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性。软骨细胞易于在弱碱性，增加Mg2+浓度的培养液中生长。由于软骨细胞包于糖蛋白基质中，必需消化方可获得软骨细胞。用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶联合消化。用品：用品：（1）Geys平衡盐溶液（GBSS），pH7.0，为防止污染可加入抗菌素，如100U/ml青霉素，100g/ml制霉菌素（2）F12培养液加12%胎牛血清，2.3m mol/L Mg2+，100U/ml链霉素，pH7.6无血清F12培养液（3）0.5%睾丸透明质酸酶，溶于GBSS，加入青霉素100

26、U/ml，链霉素100U/ml（4）0.2%胶原酶，溶于GBSS（5）0.2%胰蛋白酶，溶于GBSS（6）0.25%胰蛋白酶，溶于无Ca2+、Mg2+生理盐水 关节软骨细胞分离培养关节软骨细胞分离培养：将生后当天乳兔12只，分3次，在无菌条件下解剖分离乳兔的双侧下颌骨髁状突，仔细剥离髁状突软骨表面的纤维被膜，然后切取半透明状的髁状突软骨，用锐利小剪刀将其剪碎成1mm3 大小，放于离心管中，先用0.25%胰蛋白酶37消化30min，离心5 min（1000rpm），弃上清后加入0.1%胶原酶IA 3ml，37下消化5h后，用吸管将沉于底部的组织及细胞轻轻悬浮后，用200m滤网滤过后离心沉淀细胞，

27、再用含10%FBS DMEM培养液（含青霉素100IU/ml,链霉素100g/ml）将细胞悬浮后，接种于培养瓶在5%CO2、95%空气、饱和湿度、37孵浴箱内进行培养。软骨细胞鉴定：软骨细胞鉴定：形态观察：多角形，类似上皮样细胞，可形成具有折光性的细胞外基质，甲苯胺兰染色呈异染性。细胞组织化学染色：软骨细胞可特异性的合成葡萄糖胺聚糖（GAG）、分泌型和型胶原，并具有碱性磷酸酶活性，抗型胶原免疫组织化学染色呈阳性。（五）、骨细胞（五）、骨细胞骨细胞是终末分化的细胞，埋藏于骨基质之中。尚未见到从皮质骨中分离培养出纯骨细胞的报导，只是在进行成骨细胞培养时可见到少量星状细胞，可形成花边样网状结构。在某

28、些激素（如甲状旁腺素）的作用下，或去除培养液中血清的条件下，这些细胞可变为圆形，二羟基维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变星状。已制备出抗骨细胞的特异性单克隆抗体。（六）、成骨细胞（六）、成骨细胞 在骨组织、骨膜中均有成骨细胞。可用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法以及骨髓培养法分离培养出成骨细胞。骨组织块培养法骨组织块培养法常用骨小梁或新生鼠、兔、人胚胎颅盖骨标本。把切碎的骨组织块放入培养瓶，按常规组织块法进行培养。在培养液中加入抗胶原血清，可抑制成纤维细胞成长。骨膜组织块培养法骨膜组织块培养法将手术切取的骨膜标本清洗后切成碎块按一般组织块法进行培养。3 酶消化培养法酶消化培养法将小梁骨切成2

29、5mm3的小块，置于胶原酶和胰蛋白酶中消化，获得细胞悬液，接种培养。用品：用品：（1）常规培养器具、解剖刀、钳等（2）Hams F12培养液:（3）胰蛋白酶液：（4）骨细胞消化液：a 液：NaCL 8.0g,KCL 0.2g,NaH2PO4.H2O 0.05g，溶于100ml蒸馏水 b液：I型胶原酶137mg，型胰蛋白酶50mg溶于10ml a液中，调整pH至7.2加蒸馏水至100ml，过滤除菌，制得骨细胞消化液，分装为100ml。（5）9cm培养皿，25cm2或75cm2培养瓶骨髓培养法骨髓培养法骨髓单个核细胞在体外培养条件下可分化为成骨细胞，随着培养时间的延长，95%以上的贴壁生长细胞表现

30、出成骨细胞的特征，在原代培养时培养液中加入高浓度马血清可限制骨髓干细胞的生长，有利于单个核细胞的生长和分化。用品：用品：常规组织块法器皿，20ml注射器100U/ml肝素，含30%马血清的RPMI1640培养液，含10%胎牛血清的MEM培养液5成骨细胞鉴定成骨细胞鉴定（1）形态观察：酶消化法和骨组织块法培养生长的成骨细胞多为立方状，体积小，核圆。骨髓培养法初期细胞为圆形，两周后主要为梭形，与纤维细胞非常相似。（2）碱性磷酸酶（AP）活性检测：可采用细胞化学染色或定量测定，并以纤维细胞为对照。（3）型和型原胶原测定：成熟的成骨细胞能合成型胶原，不能合成型胶原，I型原胶原也是成骨细胞的标志物之一。

31、（4）矿化检测：成骨细胞在体外培养时能形成矿化的细胞外基质，一般培养至68周时即可出现。矿化区经Von Kossas染色呈阳性反应。（七）、破骨细胞（七）、破骨细胞脾脏和骨髓中的单个核细胞可以互相融合形成多核的破骨细胞随血流到达破骨功能活动跃的部位，在新生动物的长骨内面反复冲洗或用胶原酶消化新生动物的颅盖骨，都可获得破骨细胞，用骨髓培养法也可使单个核细胞分化为破骨细胞。1四肢长骨机械分离法四肢长骨机械分离法破骨细胞附着在四肢长骨骨干内表面，用机械冲洗法获得悬液中含有破骨细胞，可用于培养。2下蛋母鸡长骨分离法下蛋母鸡长骨分离法 下蛋母鸡在缺钙情况下骨内膜中破骨细胞数量增加，可从其长骨骨内膜获得破

32、骨细胞进行培养。3颅盖骨消化法颅盖骨消化法 用胶原酶消化新生或胚胎动物的颅盖骨可获得破骨细胞用于体外培养。用品：用品：（1）酶消化原代培养法常规器皿（2）Hanks液、HEPES液、灭活胎牛血清、青霉素、链霉素、二性霉素、1g/ml胶原酶（溶于199培养、MEM培养液）4骨髓单个核细胞培养法骨髓单个核细胞培养法 骨髓中的单个核细胞在二羟基维生素D3的作用下可分化为破骨细胞。破骨细胞鉴定破骨细胞鉴定 从四肢长骨和颅盖骨获得的培养中，往往有纤维细胞和成骨细胞与破骨细胞共同生长，且破骨细胞数量较少，用骨髓单个核细胞培养法可获得较多的破骨细胞，但也有其他骨髓细胞混杂生长。目前尚未见到纯粹破骨细胞培养及

33、破骨细胞传代培养的报导。形态观察：形态观察：破骨细胞体积大，多个核。细胞直径20100m。组织化学染色：组织化学染色：破骨细胞与抗酒石酸磷酸酶（TRACP）反应呈棕色，降钙素反应呈兰紫色，与破骨细胞单克隆抗体免疫反应呈阳性。功能观察：破骨细胞具有破骨功能。功能观察：破骨细胞具有破骨功能。（八）、内皮细胞（八）、内皮细胞内皮细胞在血管内形成单层内表面。培养方法主要是在血管内注入胶原酶使内皮细胞分离，然后培养在铺有明胶基质的培养器皿内。用品：用品：（1）无菌条件下切取血管，长10cm，直径约大于5mm（2）胶原酶：0.25%粗制胶原酶，200U/mg，溶于PBSA，加入0.5%牛血清白蛋白（3）D

34、MEM培养液：加10%胎牛血清和抗菌素（4）直径10cm的培养皿或75cm2培养瓶内表面1.5%明胶（溶剂为PBSA），培养过夜，去除多余明胶，加入培养液和血清，培养至细胞接种时鉴定：鉴定：内皮细胞能分泌第8因子（factor），吞噬低密度乙酰脂蛋白，表达内皮细胞特异性表面抗原。三、神经外胚层细胞的培养三、神经外胚层细胞的培养（一）、神经原细胞（一）、神经原细胞神经原细胞培养需要极高的营养条件，培养器皿也需要经过特殊处理，神经轴突在胶原和聚L赖氨酸溶液中可以旺盛生长，NGF可促进神经原的生长。在培养液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神经原细胞，可获得特征明显的脑神经细胞。基本方法是取新生大鼠脑，切成

35、小块，用HBSS胰酶消化，37 15min，将细胞悬液接种于聚L赖氨酸覆盖内底面的培养器皿内进行培养。鉴定：鉴定：用免疫组织化学检测神经原特异性烯醇抗体或破伤风毒素作为标记物，经可判定神经原细胞；用胶质原纤维酸性蛋白作为标记物可判断混杂在其中的胶质细胞。（二）、神经胶质细胞（二）、神经胶质细胞神经胶质细胞容易在体外培养生长。用常规的组织块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都可从幼年或成年的动物和人脑组织标本中培养出神经胶质细胞，而且生长稳定。鉴定鉴定形态学观察胶质细胞为多突起星状，用免疫组织化学方法检测胶质细胞特有的胶质原纤维酸性蛋白为阳性。（二）、神经胶质细胞（二）、神经胶质细胞神经胶质细胞容易在

36、体外培养生长。用常规的组织块法、胰酶消化法、胶原酶消化法都可从幼年或成年的动物和人脑组织标本中培养出神经胶质细胞，而且生长稳定。鉴定鉴定形态学观察胶质细胞为多突起星状，用免疫组织化学方法检测胶质细胞特有的胶质原纤维酸性蛋白为阳性。四、血细胞的培养四、血细胞的培养 以前认为血细胞都属分化终末细胞，很难在体外培养生长。近年来由于技术的发展，已有血细胞培养成功并纯化传代的报道。血细胞可从外周血中用梯度液通过离心获得，也可从脾脏中用机械法切碎过筛分离获得，从骨髓中可以获得前体血细胞，骨髓中的前体血细胞可长期培养生长，能传代，加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化。在淋巴细胞培养中加入T或B细胞生长因子，可获得具有功能的T或B淋巴细胞系，加入二羟基维生素D3，可使单个核细胞分化为破骨细胞。细胞来源鉴定的常用抗体：细胞来源鉴定的常用抗体：抗波形丝蛋白（vimetin）、细胞角蛋白（CK）、肌源性肌动蛋白（MA）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、胶原单克隆抗体及VIII因子相关抗原多克隆抗体。