血液系统研究中斑马鱼的具体运用,人体生理学论文.docx

《血液系统研究中斑马鱼的具体运用,人体生理学论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血液系统研究中斑马鱼的具体运用,人体生理学论文.docx（19页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、血液系统研究中斑马鱼的具体运用,人体生理学论文摘 要： 斑马鱼为一种硬骨淡水鱼,其胚胎透明、发育和繁衍快,且70%以上的基因与人类一样。当前广泛地应用于遗传、发育、毒理、环境污染以及药物挑选等方面的研究。本文归纳整理斑马鱼血液系统常用的实验技术和检测方式方法,同时介绍与斑马鱼血液系统研究相关的常用斑马鱼转基因品系,以期为本领域的研究提供参考,促进斑马鱼在生命科学领域的应用。 本文关键词语： 斑马鱼; 血液系统; 应用; Abstract： Zebrafish is a bony freshwater fish,its embryo is transparent,develops and rep

2、roduces quickly,and more than 87% of its genes are the same as humans.At present,it is widely used in the research of genetics,development,toxicology and environmental pollution,and drug screening.This article summarizes the commonly used experimental techniques and detection methods of the zebrafis

3、h blood system.The available transgenic lines of zebrafish have been utilized to the study of the hematological system,which provide references for the research in and promote the application of zebrafish in the field of life science. Keyword： zebrafish; hematological system; application; 斑马鱼是一种微小的热

4、带硬骨鱼，最早用于发育和遗传学研究，近年在生命科学和医药领域的研究中获得了广泛的关注和应用。斑马鱼繁衍力强，养殖成本低，遗传资源丰富，易于转基因品系的开发，适于中量挑选，是基础和应用生物医学研究的重要形式生物。通过对斑马鱼和人类参考基因组的比拟发现，70%以上的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因与之对应1。斑马鱼也是研究血液系统和造血功能非常合适的模型，斑马鱼幼鱼身体透明能够清楚地看到血液流动和心脏跳动，应用原位杂交技术，固蓝染色等技术可视化地观察血液细胞和造血相关基因的表示出，同时斑马鱼转基因品系资源丰富，能够用于对血液系统和造血功能的研究。下文将对常用的研究方式方法和实验技术进行介绍。

5、 1 、流式细胞术分析血液系统 1.1 、流式分析斑马鱼肾髓细胞群 流式细胞术前向角散射光(Forward Scatter,FSC)与细胞大小有关，侧向角散射光(Side Scatter,SSC)与细胞内部的精细构造和颗粒性质有关。成年斑马鱼的肾髓相当于哺乳动物的骨髓，是造血器官。利用FSC和SSC参数对斑马鱼的肾髓细胞进行分群，可观察到明显的5群。成熟的红细胞处于FSC低象限，髓系单核细胞(myelomonocytic cells)群中包括中性粒细胞(neutrophils，又称嗜异质粒细胞heterophilic granulocytes)、单核细胞(monocytes)、巨噬细胞(mac

6、rophages)和嗜酸性粒细胞(eosinophils，又称嗜酸碱粒细胞eo/basophils)，处在FSC高、SSC高象限细胞群中;淋巴细胞群(lymphoid cells)位于FSC中间、SSC低象限;未成熟的前体细胞位于FSC中间、SSC低象限;成熟的红细胞处于FSC低象限，沿SSC象限明显地分为两群，以分选后的华而不实一群细胞再进行流式检测仍可得到与原来类似的两群细胞，这可能是由于红细胞为椭圆形的缘故。利用微球对细胞平均大小进行测量，各群细胞的大小分别为髓系单核细胞15.2 前体细胞13.8 淋巴细胞8.3 红细胞6.2 m2。 1.2 、电离辐射对斑马鱼造血功能的损伤 电离辐射可

7、引起放射病，呈现机体的全身性反响，几乎所有器官、系统均发生不同程度的病理改变，而人体的血液系统、神经系统、消化系统和生殖系统对损伤最为敏感。根据电离辐射对人体造成损害的方式，能够分为直接作用和间接作用两种途径，直接作用是辐射的能量累积在DNA、蛋白质、酶类、脂类、MicroRNA等生物大分子上引起电离和激发，使化学键断裂、分子变性和细胞构造毁坏3。而间接作用是电离辐射作用于有机体内的水分子，并使其电离产生大量的自由基攻击体内的大分子物质如DNA、蛋白质等，进一步导致细胞的构造改变和功能损伤，造成细胞的氧化损伤4。由于血液细胞和造血组织对于电离辐射的敏感度高5，遭到电离辐射后人体的血液系统的细胞

8、最先发生形态构造上的变化，随之功能遭到影响。 David6等，研究了电离辐射对斑马鱼肾髓细胞的影响。他们给予成年斑马鱼20 Gy的电离辐射照射，在1、4、8、10、14、30 d利用FSC和SSC分群，观察肾髓中红细胞、髓系单核细胞、前体细胞和淋巴细胞比例的变化和总数量的变化，发现辐射后红细胞的占比快速从50%左右增加到70%左右，在辐射后第4、7、10、14、30 d，随着时间的延长占比逐步减少;而髓系单核细胞、前体细胞和淋巴细胞三群细胞的占比在电离辐射后18 d逐步减少，8 d之后细胞的比例逐步增加，表示清楚造血能力加强，到第30 d，三群细胞逐步恢复，甚至超过电离辐射前的水平，十分是前体

9、细胞大量增殖。而各群细胞的总数量也经历了从减少到增加的经过。 观察斑马鱼电离辐射后肾髓细胞的整个动态变化经过可知，髓系单核细胞、前体细胞和淋巴细胞对电离辐射特别敏感，电离辐射后细胞占比急剧下降，而辐射对红细胞的影响相对较小。在电离辐射第30 d，因辐射损伤死亡的细胞数量逐步被新生细胞所补充，甚至高于电离辐射前的水平。 1.3、 造血活性物质挑选 North7等研究了一系列生物活性化合物对电离辐射后的成年斑马鱼肾髓造血的影响。在斑马鱼遭到23 Gy辐射后第2 d，给予不同浓度的生物活性化合物，利用FSC和SSC进行细胞分群，分别在药物处理后的第4、7、10、14 d观察肾髓红细胞、髓系单核细胞、

10、前体细胞和淋巴细胞比例的变化，实验发现肾髓前体细胞的升高明显，继而髓系单核细胞、淋巴细胞和红细胞逐步升高，表示清楚前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)能够促进辐射后受损伤的造血功能的恢复。 2 、固蓝染色幼鱼红细胞 2.1、 红细胞数量检测 红细胞包含很多类似于肝脏和其他组织中催化异源代谢的酶，因而能够催化典型的单加氧酶反响，包括O-和N-去甲基化以及芳族和脂肪族羟基化等，血红蛋白在联苯茴香胺和过氧化氢的体系中能够催化其反响在血红蛋白外表构成铁锈色沉淀，沉淀的面积和颜色的深浅能够用来指示斑马鱼体内血红蛋白的含量，进一步反映红细胞的数量，可用来判定处理因素对红细胞的影响8。

11、 2.2、 药物挑选 Manali9等用0.5 g/m L苯肼处理33 hpf(hours past fertilization)斑马鱼幼鱼，造成斑马鱼幼鱼溶血性贫血，在54 hpf96 hpf给予不同的小分子药物处理后进行固蓝染色，分析尾部造血组织(Caudal Hematopoietic Tissue,CHT)的平均光密度值，以指示CHT红细胞的多少，进而挑选对于溶血性贫血有保卫作用的小分子化合物。 3、 荧光实时定量PCR检测mRNA表示出 3.1 、实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)是一种在DNA扩增反响中

12、，以荧光化学物质监测每次聚合酶链式反响循环后产物总量的方式方法。通过内参或者外参法对样品中的特定DNA序列的表示出量进行定量分析10。从斑马鱼组织中提取RNA，将其转录为c DNA，利用qRT-PCR方式方法测定c DNA的含量，进而完成对斑马鱼特定mRNA含量的测定，从mRNA的含量推断特定DNA序列的表示出变化。 3.2 、造血转录因子的检测 Kasem14等研究了一个斑马鱼的贫血模型。他们将幼年斑马鱼进行两周的17低温培育，后正常26.5饲养1个月，未进行低温处理的斑马鱼作为对照组。取斑马鱼的肾髓提取RNA，进行qRT-PCR检测，发现编码造血转录因子(Runx1、scl、cmyb和ga

13、ta2)，十分是促红细胞生成素相关因子(klfd、hbaa1、ba1、gata1、EPO和EPOr)的表示出上调，而髓系造血相关因子(csf1a和csf3)在低温条件下调。 Paffett-Lugassy12等通过qRT-PCR对不同发育阶段的斑马鱼的EPO的表示出进行了研究发现，32hpf细胞期至24 hpf检测到EPO的低表示出，而在36 hpf处出现一个微小的表示出峰，此后表示出水平不变，直到814 dpf其表示出迅速增加。在成年鱼体中，EPO转录本可在心脏高表示出，在大脑、肝脏和肾脏表示出较低，在脾和大肠没有表示出。斑马鱼发育经过和组织EPO的变化规律与哺乳动物特别类似，进而证明斑马鱼

14、的造血功能与哺乳动物类似，表示清楚在脊椎动物中造血调控具有高度保守性。 4 、原位杂交技术检测mRNA表示出 4.1 、原位杂交技术 在斑马鱼中使用全原位杂交(Whole-Mount In Situ Hybridization,WISH)技术已经有几十年的历史。斑马鱼幼体是光学透明的，使得对RNA的表示出进行定位化、可视化观察很容易，十分是对特定时期的RNA的表示出进行定量观察13。在原位杂交技术中，需要一个特定标记的反义核酸探针根据碱基互补配对的原则与原始细胞或组织中的核酸进行杂交，构成杂交体，杂交体经过显色反响能够在显微镜下观察其细胞或组织中的RNA，颜色的深浅表示RNA表示出的高低，进而

15、实现定量和定位14的观察。 4.2 、药物挑选 North7等利用原位杂交技术研究了几个代表性的前列腺素冲动剂和拮抗剂对3 hpf斑马鱼胚胎的造血干细胞的影响，发现inoleic acid增加了runx1+/myb+干细胞的数量，celecoxib减少了这类干细胞的数量。 5 、转基因斑马鱼 转基因技术的核心是将人工分离或修饰过的基因有目的性地导入到生物体基因组中，使得该基因表示出，且该基因和其造成的性状改变能够遗传给下一代。在斑马鱼中进行转基因技术的应用实际上是通过显微注射技术，将外源基因通过注射导入斑马鱼受精卵中，再通过基因组挑选获得稳定遗传外源基因的品系15,16。在转基因斑马鱼模型中，

16、尤其值得注意的是表示出荧光蛋白的品系，由于斑马鱼幼鱼鱼体透明，非常易于在显微镜下观察。表示出荧光蛋白转基因斑马鱼品系已被用于药物发现挑选、安全性评估、发育生物学和环境毒理学等众多研究领域。而不同血液细胞的特异转录因子或蛋白进行标记的荧光蛋白的品系，对于研究血液细胞的特化以及病理生理的变化非常重要，下面介绍几种常见的表示出荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。 5.1 、红系细胞转基因斑马鱼品系 gata1也称红系转录因子1，是gata转录因子家族成员，在红系细胞分化经过中起着至关重要的调控作用。在斑马鱼红系细胞的发育经过中，红细胞和红系骨髓祖细胞(erythromyeloid progenitor,EM

17、P)等红系相关细胞高表示出gata1，所以在斑马鱼中gata1是红系细胞特化和维持的关键的调节因子17。在Tg(gata1:dsRed)转基因的斑马鱼胚胎中用荧光显微镜观察斑马鱼胚胎红系细胞会表示出特异性红色荧光。 Ferri-Lagneau18等利用Tg(gata1:dsRed)转基因斑马鱼胚胎，研究了生姜提取物对体内造血的影响，确认了生姜提取物促进了gata1在红系细胞中的表示出，增加了造血祖细胞标志物cmyb和scl的表示出。进一步研究发现生姜提取物能通过增加表示出gata1红系细胞数量，促进苯肼所导致的斑马鱼急性溶血性贫血的造血功能恢复。 Tg(gata1:dsRed)转基因斑马鱼标记

18、的是红系的细胞群体，而华而不实包括红细胞、红系骨髓祖细胞、不成熟的早幼红细胞、中幼红细胞等2。对红细胞不同发育阶段的精细调控需要更多的阶段特征性标志物进行标记。 Lenard19等将Tg(gata1:dsRed)和Tg(globin:GFP)的两个品系进行交配，构成具有双色荧光的转基因斑马鱼品系。华而不实globin是在红细胞中特异表示出的蛋白，通过共定位图片能够清楚地观察到成熟的红细胞高表示出gata1和globin，成功地将红细胞从红系细胞中区分出来。通过流式的红色和绿色荧光通道进行分群，可以以将红细胞从红系细胞中分离出来构成两群。 Bertrand20等利用流式对Tg(gata1:dsR

19、ed)和Tg(lmo2:e GFP)共表示出的24-48 hpf的斑马鱼胚胎中同时高表示出lmo2和gata-1的细胞群进行分选。对分选后的细胞的基因表示出进行研究，发现该群细胞是同时具有髓系和红系的特征，该群细胞并非成熟的红细胞而属于EMP。 5.2、 髓系细胞转基因斑马鱼品系 斑马鱼中性粒细胞能够特异性的表示出髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),MPO高表示出可作为鉴定斑马鱼中性粒细胞的标志。早在18 hpf胚胎，就能够在中间细胞群检测到斑马鱼MPO mRNA的表示出，在3 dpf(days post fertilization)，循环血细胞中可以以检测到MPO的表示出

20、。Mathias21等成功构建了Tg(mpx:GFP)斑马鱼转基因品系，并利用该品系研究炎症反响下斑马鱼中性粒细胞的趋向性。当组织损伤时引起强烈的炎症反响，其特征是中性粒细胞迅速向伤口部位聚集。使用体内延时成像观察斑马鱼，可见炎症诱发后中性粒细胞随即表现为从血管系统向外的逆向趋化。 斑马鱼幼鱼时期溶菌酶C是由从髓系细胞分化而来的巨噬细胞和中性粒细胞产生的，所以Hall22等将绿色荧光蛋白转入斑马鱼溶菌酶C基因的启动子构建了Tg(lyz:e GFP)斑马鱼品系，该品系能够标记部分巨噬细胞和中性粒细胞。 在上文介绍的斑马鱼转基因品系Tg(mpx:e GFP)中，表示出荧光信号高的一群细胞为中性粒细

21、胞，荧光信号较低的细胞亚群，其构造特征是巨噬细胞。Lawson23等构建的Tg(fli1a:e GFP)斑马鱼转基因品系被用来研究胚胎损伤的原始巨噬细胞的行为，但fli1a在原始白细胞和内皮细胞中均有表示出，所以此品系特异性较差。 为解决这一问题，Ellett24等利用巨噬细胞特异性标记物mpeg1构建斑马鱼转基因品系Tg(mpeg1:e GFP),mpeg1最初被以为是一个在人类和小鼠巨噬细胞中特异表示出的基因，随后被广泛地用于哺乳动物和斑马鱼中标记巨噬细胞，mpeg1转基因品系的中性粒细胞不被标记，进而成功区分了中性粒细胞和巨噬细胞。他们利用这一品系的斑马鱼，比拟了中性粒细胞和巨噬细胞损伤

22、后的不同动态行为及其互相作用，这为炎症、感染和白细胞生物学等领域提供了新的研究资源。 斑马鱼作为一种新型的形式动物，与传统的小鼠、大鼠模型相比具有众多优势，十分是其可视化、高通量、给药量小、遗传背景清楚等特点，非常合适研究血液系统的发育、损伤和修复，为这一领域提供了一个新颖实用的动物模型。同时流式细胞技术、原位杂交技术、实时荧光定量PCR和固蓝染色在斑马鱼模型的应用，以及越来越多斑马鱼转基因品系的应用，为研究血液系统的研究提供了有力的支持。 以下为参考文献 1KONG E,SHUK C,KWAN Y. Zebrafish as an in vivo model to assess epigen

23、etic effects of ionizing radiationJ. International Journal of Molecular Sciences,2021,17(12):2108. 2TRAVER D,PAW B H,POSS K D,et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutantsJ. Nature Immunology,2003,4(12):1238-1246. 3SINGH V K,GARCIA M,SEED T M.

24、A review of radiation countermeasures focusing on injury-specific medicinals and regulatory approval status:part II. Countermeasures for limited indications,internalized radionuclides,emesis,late effects,and agents demonstrating efficacy in large animJ. International Journal of Radiation Biology,202

25、1:1-15. 4仪丽荣.丙二醇对小鼠造血系统辐射损伤的防护作用及其机制研究D.北京:中国疾病预防控制中心,2022. 5苌凤锦,彭代银.中药抗辐射作用的研究进展J.安徽医药,2018,15(07):902-905. 6TRAVER D,WINZELER A,STERN H M,et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantationJ. Blood,2004,104(05):1298-1305. 7NORTH TE G W W C. Prostaglan

26、din E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasisJ. Nature,2007,447(7147):1007-1011. 8MIEYAL J J,STARKE D W. Hydroxylation and dealkylation reactions catalyzed by hemoglobinJ. Methods in Enzymology,1994,231(03):573-598. 9MANALI D,JAYADEV J,RINA C,et al. Todralazine protects zebrafish

27、from lethal effects of ionizing radiation:role of hematopoietic cell expansion.J. Zebrafish,2021,40(01):8-15. 10SINGH C,ROY-CHOWDHURI S. Quantitative real-time PCR:recent advancesM. New York:Humana Press,2021. 11KULKEAW K,ISHITANI T,KANEMARU T,et al. Cold exposure down-regulates zebrafish hematopoie

28、sisJ. Biochemical and Biophysical Research Communications,2018,394(04):864. 12PAFFETT-LUGASSY N,HSIA N,FRAENKEL P G,et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafishJ. Blood,2021,110(07):2718-2726. 13JENSEN E. TECHNICAL Review:In Situ HybridizationJ. The Anatomical Record:Advan

29、ces in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology,2020,297(08):1349-1353. 14THISSE B,THISSE C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvaeJ. Methods in Molecular Biology,2020,(1211):53-67. 15LEE O,GREEN J M,TYLER C R. Transgenic fish systems and their application in eco

30、toxicologyJ. Critical Reviews in Toxicology,2021,45(02):124-141. 16李阔宇,潘鲁湲,孙永华.斑马鱼资源的开发保藏与国家斑马鱼资源中心J.中国实验动物学报,2020,40(08):683-692. 17MARIA R D,ZEUNER A,ERAMO A,et al. Negative regulation of erythropoiesis by caspase-mediated cleavage of GATA-1J. Nature,1999,401(6752):489-493. 18FERRI-LAGNEAU KF M K

31、G M. Ginger stimulates hematopoiesis via BMP pathway in zebrafishJ. PLo S One,2020,7(06):e39327. 19LENARD A,ALGHISI E,DAFF H,et al. Using zebrafish to model erythroid lineage toxicity and regenerationJ.Haematologica,2021,101(05):e164-e167. 20BERTRAND J Y,KIM A D,VIOLETTE E P,et al. Definitive hemato

32、poiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryoJ. Development,2007,134(23):4147-4156. 21MATHIAS J R,PERRIN B J,LIU T X,et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafishJ. Journal of Leukocyte Biology,2006,80(06):

33、1281-1288. 22KATHY C,THILO S,MARIA F,et al. The zebrafish lysozyme c promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fishJ. Bmc Developmental Biology,2007,7(01):42. 23LAWSON N D,WEINSTEIN B M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafishJ. Developmental Biology,2002,248(02):318. 24ELLETT F,PASE L,HAYMAN J W,et al. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafishJ. Blood,2018,117(04):49-56.