人腺癌细胞株A549中HIF-1α对生存素的影响,肿瘤学论文.docx

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1、人腺癌细胞株A549中HIF-1对生存素的影响,肿瘤学论文缺氧是实体瘤生长微环境的显着特征。肿瘤细胞在缺氧环境下发生一系列适应性变化，而缺氧诱导因子是缺氧条件下哺乳动物对缺氧反响的主要调节因子。Semenza 等于 1992 年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现了氧敏 亚基HIF-1 和表核 亚基HIF-1 ，华而不实 HIF-1 是主要的活性单位。缺氧时，HIF-1 表示出增加并移入核内与 HIF-1 结合，构成有活性的异二聚体 HIF-1，与靶基因的启动子或加强子内的一个或多个缺氧反响元件hypoxia response element，HRE结合，促进肿瘤 血 管 系 生 成 和 肿 瘤 细

2、 胞 的 增 殖 。生存素是当前公认的癌基因，文献报道缺氧时 HRE 与生存素启动子结合，导致生存素的表示出增加。研究发现缺氧诱导的生存素表示出依靠和非依靠 HIF-1 途径。本研究前期实验证实，非小细胞肺癌NSCLC组织中生存素蛋白和 HIF-1 蛋白高表示出且两者表示出呈正相关，靶向 HIF-1 的短发夹 RNAshort hairpin RNA，shRNA可明显下调生存素表示出。本研究通过凝胶电泳迁移率实验EMSA验证人腺癌细胞株A549中HIF-1 能否与生存素启动子上潜在位点相结合，证实 HIF-1 结合位点的存在；miRNA 干扰技术沉默 HIF-1 的表示出，进一步论证其对生存素

3、的影响及对 A549 细胞株生物学特性的影响，为肺癌的发病机制提供实验根据。 材料与方式方法 1. 主要试剂与材料：A549 细胞购自上海中科院细胞库；EMSA 试剂盒美国 Promega 公司，批号：237021；放射性 P 标记的 ATP -32PATP购自北京市福瑞生物工程公司；G25 葡聚糖凝胶购自上海医药工业研究院；核蛋白提取试剂盒美国Thermo 公司，批号：78833；鼠抗人生存素抗体美国 Santa Cruz 公司，批号：SC374616，兔抗人 HIF-1 抗体北京博奥森生物公司，批号：bs-0737R，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG北京中杉金桥生物公司，批号：83228

4、兔抗鼠 IgG美国 Santa Cruz 公司，批号：sc66931；总 RNA提取试剂盒德国 Qiagen 公司，批号：74104；逆转录试剂盒美国 Promega 公司，批号：253082，PCR 扩增试剂盒加拿大 MBI Fermentas 公司，批号：K1621；生存素探针、所有的引物由上海生工合成；F-12 培养基和胎牛血清美国 Hyclone 公司，批号 F03039；六水氯化钴CoCl2，上海国药公司；Transwell 小室美国 Corning 公司；Annexin-V APC 和 PI美国 eBioscience 公司；CCK-8细胞计数试剂盒碧云天生物技术研究所；杀稻瘟菌素

5、blasticidin，含有 pcDNA6.2-GW/EmGFP 针对 HIF-1 基因号 NM001530的miRNA 4 组干扰质粒及阴性对照组、含有内参的miRNA 质粒，Lipofectamine脂质体TM2000 转染试剂盒美国 Invitrogen 公司，批号 11668-019。 2. 细胞培养及乏氧的处理：A549 细胞以含10%胎牛血清的 F-12 培养液，于 37 、5% CO2培 养 箱 中 常 规 培 养 。 将 化 学 缺 氧 剂 CoCl2150 mol/ml 参加培养液中，模拟肿瘤内部的缺氧微环境。 3. EMSA 检测生存素核心启动子区上的HIF-1 位点：根据

6、核蛋白提取试剂盒讲明书提取A549 细胞中核蛋白并定量。用 -32P 标记探针合成双链后纯化，EMSA 电泳，室温下显影、定影。实验分组如下：阴性对照反响只要标记好的探针、结合反响含有核蛋白和标记好的探针、探针冷竞争反响含有核蛋白、未标记的探针和标记好的探针、突变探针的冷竞争反响含有核蛋白、未标记的突变探针和标记好的探针和超迁移Super-shift反响含有核蛋白、目的蛋白特异抗体和标记好的探针。各探针如下：探针1：生存素启动子269 bp上链序列 5 -GAGGGCGTGCGCTCCCGA-3 ，下链序列 3 -CTCCCGCACGCGAGGGCT-5 ，探针 2：生存素启动子144127

7、bp上链序列 5 -GTCGCTGGGTGCACCGCG-3 ，下链序列 3 -CAGCGACCCACGTGGCGC-5 ，探针 1 突变的序列：上链序列 5 -GAGGGCAGCGCTCCCGA-3 ， 下 链 序 列 3 -CTCCCGTCGCGAGGGCT-5 ，探针 2 突变的序列：上链序列5 -GTCGCTGGAGCACCGCG-3 ， 下 链 序 列3 -CAGCGACCTCGTGGCGC-5 ，HIF-1 通用双链寡聚核苷酸序列EMSA 试剂盒提供：上链序列 5 -TCTGTACGTGACCACACTCACCTC-3 ，下链序列 3 -AGACATGCACTGGTGTGAGTGG

8、AG-5 。 4. HIF-1 稳定沉默 A549 细胞的建立：转染前1 d 取对数生长期的 A549 细胞接种于 6 孔板中，每孔参加 2 ml 含 2 105个细胞但不含抗生素的培养液，转染时细胞的融合度到达 90%95%。实验分组：未处理组、miRNA14 转染组及 miRNA 阴性、 -肌动蛋白 miRNA 对照组。转染实验步骤根据Lipofectinamine脂质体TM2000 讲明书进行，质粒 g脂质体 l11，经blasticidin10 g/ml，34 周挑选后挑出单克隆细胞扩大培养。 5. RT-PCR 检测 HIF-1 、生存素的 mRNA 表示出：转染后各组细胞根据德国

9、Qiagen 公司 RNA 提取试剂盒讲明书提取总 RNA，然后按 RT-PCR 试剂盒讲明将 RNA 逆转录为 cDNA，以此为模板进行 PCR。RT-PCR 引物序列、扩增长度及反响条件分别如下：HIF-1 上游引物： 5 -AGCCAGACGATCATGCAGCTACTA3 ，下游：5 -TGTGGTAATCCACTTTCATCCATTG-3 ，产物长度 167 bp。PCR 三步反响：94 、30 s，59.2 、30 s，72 、30 s，35 个循环；生存素上游引物 5 -AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3 ，下游引物 5 -TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3

10、 ，产物长度 147 bp；94 、30 s，63.9 、30 s，72 、30 s；30 个循环，内参 GAPDH 上游引物：5 -GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ，下游引物：5 -AGCAGAGGGGGCAGAGATGAT-3 ，长度 375 bp；95 、30 s，63 、45 s，72 、60 s，30 个循环。美国伯乐 Bio-Rad 凝胶成像仪下观察结果并拍照分析。 6. Western blot 检测 HIF-1 和生存素蛋白的表示出 ： 提 取 各 组 细 胞 的 核 蛋 白 ， 二 喹 啉 甲 酸Bicinchonininc acid，BCA法测定蛋白浓度，每

11、组样本各取蛋白 60 g，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜上，经 5%脱脂奶粉封闭 1 h室温后，分别参加一抗兔抗人HIF-1 1300、鼠抗人生存素抗体1200，4 过夜，参加辣根过氧化物酶标记的二抗110 000室温孵育 1 h，化学发光法显色，以 -肌动蛋白工作浓度 1500为内参照。用 Quantity One 软件分析条带的吸光度。 7. 细胞增殖检测：经 RT-PCR 及 Western blot挑选出干扰效果最佳的 HIF-1 -miRNA 细胞，将HIF-1 miRNA、HIF-1 阴性及未处理的 A549 各组细胞接种 2 103/孔于 96 孔板，

12、每组设 6 个复孔，分别在 5% CO2培养箱中常规培养及参加 CoCl2150 mol/ml 模拟缺氧培养 24 h、48 h 及 72 h，每孔参加 10 l CCK8 37 孵育 1 h，在酶标仪上 450 nm处测定各孔吸光度值。 8. 细胞凋亡检测：各组细胞 2 105/ml 接种于6 孔板，在 5% CO2培养箱中和参加CoCl2150 mol/ml分别培养24 h48 h及72 h后收集细胞，1 500 r/min离心 3 min，离心半径 100 mm，PBS 洗涤 2 次，用1 Binding Buffer结合缓冲液195 l 重悬细胞，参加 Annexin-V APCCa2

13、依靠性磷脂结合蛋白及碘化丙啶PI各 5 l，4 避光室温孵育 15 min，流式细胞仪检测，Cell Quest 软件分析。 9. 细胞的迁移力：取处于对数生长的各组A549 细胞消化、离心和计数，用无血清的 F-12 培养液调整细胞密度为 5 105/ml。在 Transwell 小室下层均参加 500 l F-12 培养液含 10% FBS，小室上层常氧组参加 100 l 细胞悬液，缺氧组上层参加含 CoCl2150 mol/L 的 100 l 细胞悬液，每组细胞 3 个复孔，重复 3 次。放置在 37 ，5% CO2培养箱中培养 24 h 后取出，用棉签轻轻擦去膜上层的细胞，膜下层用甲醇

14、固定 30 min，Giemsa吉姆萨染色 10 min，PBS 冲洗 2 遍，倒置显微镜下选取 10个视野 400进行细胞计数。 10. 统计学分析：采用 SPSS 16.0 统计学软件，计量资料以均数 标准差 x s表示，组间比拟采用单因素方差分析和 t 检验，两两比拟采用 q检验，P0.05 为差异有统计学意义。 结 果 1. EMSA 验证 HIF-1 与生存素结合位点：生存素启动子序列269 bp 为探针与核蛋白作用，自显影后出现 DNA-核蛋白复合物滞后条带，此条带可被未标记的探针竞争消除；用含有 HIF-1 的通用辨别 DNA 片段为探针时，产生了与生存素启动子序列269 bp

15、为探针时相近的 DNA-核蛋白复合物。表示清楚 HIF-1 与生存素启动子序列269 bp 结合，生存素启动子上1916 bp位点是 HIF-1 的结合位点图 1。 2. 稳转细胞的鉴定： A549 细胞分别转染HIF-1 miRNA14，miRNA-阴性、miRNA- -肌动蛋白对照质粒，挑取细胞单克隆进行扩增培养后在荧光显微镜下可见绿色荧光GFP，表示清楚真核重组质粒稳转成功。 3. 挑选 HIF-1 miRNA 载体：转染 HIF-1 miRNA3、4 实验组0.313 0.051，0.415 0.051的 A549 细胞 HIF-1 mRNA 的表示出低于未处理组1.042 0.036

16、和阴性对照组1.030 0.004，差异有统计学意义F436.433，P0.0.5，因而选择转染 HIF-1 miRNA-3 的细胞株作为后续增殖、凋亡和迁移的实验组，同时检测干扰 HIF-1 后生存素 mRNA 的表示出，发现生存素 mRNA 也相应降低，以 miRNA3mRNA 吸光度值为 0.060 0.008效果最佳，差异具有统计学意义F0.002，P0.01图 2，3。用 Western blot 法检测 A549细胞中的 HIF-1 和生存素蛋白水平变化，显示HIF-1 miRNA3 组的 HIF-1 0.559 0.051和生存素蛋白0.051 0.003表示出明显低于未处理组1

17、.452 0.146 和 0.194 0.007和 miRNA 阴性组1.249 0.012 和 0.173 0.005，差异有统计学意义F53.525，331.646，P0.05图 4。 4. HIF-1 miRNA 在缺氧条件下的表示出：HIF-1 沉默组 HIF-1 0.604 0.040和生存素mRNA0.394 0.018表示出明显减低，各组和常氧条件下相比，HIF-1 和生存素 mRNA 表示出明显增高，差异有统计学意义t 值分别为 7.809，28.936，P0.01。Quantity One 定量分析 HIF-1 沉默组HIF-1 和生存素蛋白表示出明显低于常氧条件下，且各组的

18、蛋白水平明显高于常氧t 值分别为 13.523和14.202，差异有统计学意义P0.01图 5。 5. HIF-1 miRNA 对细胞增殖、凋亡和迁移的影响：1常氧和缺氧条件下 HIF-1 miRNA 对A549 细胞增殖的影响：HIF-1 沉默组与未处理组、阴性对照组比拟，A549 细胞生长遭到抑制，但差异没有统计学意义F2.426，0.151，0.542，P0.05。缺氧 24 h 后 HIF-1 沉默组与各组比拟，细胞生长明显遭到抑制，差异具有统计学意义F8.048，5.699，34.087，P 均0.05，而对照组间无统计学意义表 1，2。 2常氧和缺氧条件下 HIF-1 miRNA

19、对 A549细胞凋亡的影响：常氧条件下 HIF-1 沉默组平均凋亡率 46.2%这是通过流式细胞仪软件测每个门内的比率，指的是细胞计数百分比与各对照组比拟未处理组 44.6%，阴性组 44.3%，无统计学差异F2.009，P0.05；模拟缺氧培养 48 h后实验组平均凋亡率为 62.2%，与各对照组比拟凋亡明显增加，差异具有统计学意义F26.359，P0.01，而未处理组平均凋亡率为 51.4%，阴性组平均凋亡率为 54.5%，两两比拟差异没有统计学意义t0.077，P0.05。 3常氧和缺氧条件下 HIF-1 miRNA 对 A549细胞迁移力的变化：常氧和缺氧条件下干扰 HIF-1 后细胞

20、迁移数明显减少，分别为 30 6F21.924，P0.05和 75 4F170.827，P0.01，和对照组121 17比拟差异有统计学意义，且缺氧状态下细胞的迁移数明显多于常氧状态下的细胞数t2.988，P0.01。 讨 论 肺癌是当今全球发病率最高的恶性肿瘤，病死率居癌症首位，70%80%的肺癌患者确诊时已属于晚期，5 年生存率仅有 16%。因此说明肺癌中高表示出且特异性强的异常基因的功能及相应的调控机制，揭示肺癌发病机制，寻求新的治疗措施成为肿瘤学家的共鸣。 缺氧 是 实体瘤中普遍存在的现象，也是肺 癌等实体瘤生长微环境的显着特征。在这种实体瘤适应缺氧的转录调节中，HIF-1 起着重要作

21、用，它通过调节一系列基因来维持氧和营养的供应，促进肿瘤的生存和生长。文献报道，在乳腺癌和直肠癌细胞中 HIF-1 和生存素有很强的相关性，我们前期也证实在NSCLC中HIF-1 对生存素表示出存在上调作用且具有肿瘤特异性。 生存素是凋亡抑制蛋白inhibitor of apoptosisproteins家族的成员之一，除了抑制凋亡和保卫细胞的存活外，亦介入血管构成，甚至对肿瘤的浸润、转移和耐药也有作用。很多癌症患者体内生存素水平升高决定了其对放化疗反响的不敏感及预后不良，都与缺氧有关。缺氧下肿瘤特异性的生存素表示出增加，和生存素启动子的缺氧反响原件HREs结合导致生存素进一步增加。Peng 等

22、报道乳腺癌中 survivin 通过 HIF-1 上调 EGF 处理的癌细胞而过表示出 ；转染 HIF-1 小干扰 RNAsiRNA至直肠癌 LS174T 细胞后，抑制 HIF-1 后导致生存素的表示出下降，显示 HIF-1 对生存素表示出可能有调节作用。本研究通过 EMSA 证实生存素启动子1916 bp 区存在 HIF-1 结合位点，并证实HIF-1 对生存素启动子具有正向调控作用。 miRNA 不仅具有调节细胞增生、分化和活性的功能，还介入生命经过中一系列重要进程。相对于 siRNA 而言，miRNA 在转录后沉默基因的表示出更强。为进一步探明 HIF-1 对生存素的转录调控机制，用 m

23、iRNA 抑制 HIF-1 的表示出，观察对生存素转录和翻译的影响。结果显示，在常氧和缺氧条件下，生存素的转录和蛋白水平的表示出均明显减低，进一步证实 HIF-1 在转录水平调控生存素，生存素可能是 HIF-1 下游的靶基因。抑制 HIF-1 表示出，细胞在 CoCl2氯化钴模拟缺氧处理后，生长遭到抑制，且出现凋亡；而在常氧下未出现这种现象。尽管在抑制 HIF-1 的乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型中，移植瘤生长明显减慢；本研究结果显示，仅在缺氧条件下沉默 HIF-1 才能抑制细胞增殖，促使细胞凋亡，可能是体外和体内肿瘤细胞生长微环境不同。在迁移实验中，用 miRNA 沉默 HIF-1 后，无论在常氧

24、还是缺氧条件下，肿瘤细胞的迁移明显遭到抑制，这与增殖和凋亡结果不同，且在缺氧状态下迁移细胞数更多。在乳腺癌中上调 HIF-1 信号通路伴随着微转移灶的分子信号上调，Krishanlnachary 等利用 HIF-1 特异的siRNA 抑制人结肠癌细胞相关基因表示出，降低由于缺氧和 HIF-1 过表示出导致的肿瘤细胞侵袭转移能力。近期报道 HIF-1 可促进肿瘤细胞的迁移，牡荆黄素一种 HIF-1 抑制剂能够显着抑制大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 细胞的迁移。我们的结果与这些相关报道相吻合，表示清楚 HIF-1 在肿瘤细胞的迁移中起着核心作用，它过表示出促进癌细胞的转移，与其加强肿瘤细胞游走能力有关，

25、但与缺氧关联不大。揣测活化细胞迁移的相关基因是通过依靠HIF-1 的机制。这一切能否与生存素关联，并与肺癌易于早期出现局部浸润和远处转移有关，尚待进一步研究。 参 考 文 献 1 Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoietin geneenhancer at a site required for transcriptional activationJ. Mol CellBiol, 1992, 12(12

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