血管紧张素Ⅱ作用下人脐动脉平滑肌细胞缺氧诱导因子1α的表达,病理学论文.docx

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1、血管紧张素作用下人脐动脉平滑肌细胞缺氧诱导因子1的表达,病理学论文 肾素-血管紧张素系统( renin-angiotensin sys-tem,RAS) 的激活引起高血压,血管紧张素( an-giotensin ,Ang) 作为该系统的最终效应分子,可上调人脐动脉平滑肌细胞( human umbilical arterysmooth muscle cells,HUASMC) 缺氧诱导因子 1( hy-poxia-inducible factor-1,HIF-1 ) 的表示出,增加其下游血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growthfactor,VEGF) 表示出,

2、具有促 HUASMC 增殖1的作用,是导致高血压血管阻力增加的原因之一.HIF-1 是缺氧调节中的重要因子,其表示出主要受氧浓度影响,低氧可在转录和翻译水平激活 HIF-1 的表示出,对其下游基因进行调节,产生一系列代偿或病理反响,在氧稳态调节、低氧适应等方面发挥重要作用.除此之外,Ang、凝血酶等非缺氧刺激也能上调HIF-1 的表示出2.Ang可通过不同机制在转录或翻译水平影响 HIF-1 的表示出3,可以在翻译后水平影响细胞 HIF-1 的稳态,如: 在翻译后水平影响HIF-1 的羟化.脯氨酸羟化酶( prolyl hydroxylases,PHD) 和缺氧诱导因子 1 抑制因子( fac

3、tor inhibitinghypoxia-inducible factor-1,FIH-1) 是羟化 HIF-1 的关键酶.哺乳动物有 3 种 PHD: 即 PHD1、PHD2 和PHD3,其相对活性大小为 PHD2 PHD3 PHD1,PHD2 对 HIF-1 的调节呈氧依靠性,是常氧状态下维持 HIF-1 稳态水平的关键限制酶4.常氧时PHD2 与 FIH-1 羟化 HIF-1 ,使之迅速降解; 缺氧时,PHD2 失去活性、FIH-1 酶活性受抑制,HIF-1 降解受阻,在胞内积聚并转位入核,促进其下游低氧反响基因的转录,引起细胞对低氧的一系列反响.Pag 等5研究表示清楚,在 HUAS

4、MC 中,Ang通过调节细胞内抗坏血酸浓度改变 PHD2 的活性,在翻译后水平改变 HIF-1 的羟化,影响胞内 HIF-1 的稳定性,PHD2 基因与蛋白的表示出不受 Ang的影响.Ang对 HUASMC 中 FIH-1 的影响及其详细机制怎样尚未见报道.本研究拟通过观察 Ang对HUASMC 中 HIF-1 、VEGF 以及 PHD2、FIH-1 和 p-ERK 表示出的影响,讨论 PHD2、FIH-1、p-ERK 在 Ang影响 HIF-1 表示出中的作用; 并用 ERK 信号通路抑制剂 PD98059 阻断 ERK 信号通路激活,讨论ERK 通路在 Ang 作用下介导 FIH-1 影响

5、 HIF-1 的可能机制. 1 材料和方式方法 1. 1 主要材料 HUASMC 购于美国 Scien Cell 公司; Ang购于美国 Sigma 公司; 细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白消化酶、RIPA 裂解液购于瑞典 Gibco 公司; 青霉素和链霉素购于美国 Sigma 公司; 兔抗 HIF-1 、兔抗PHD2 购于瑞典 Novus Bioscience 公司; 兔抗 VEGF、兔抗 FIH-1 购于英国 Abingdon 公司; HRP 标记的二抗购于瑞典 Amersham Biosciences 公司; PVDF 膜购于美国 Millipore 公司; ECL 显色试剂盒购于 GEHe

6、althcare 公司. 1. 2 HUASMC 的复苏、传代培养及分组 将细胞冻存管从液氮中取出,迅速复温到 37,将细胞悬液吸入 15 mL 离心管,1000 r/min 离心 5min,弃上清,以含 20% 胎牛血清的细胞培养基 15 mL吹打,制成细胞悬液,用5 mL 移液器转移细胞悬液至一次性细胞培养瓶中,放入 37、5% 的 CO2培养箱中培养.待细胞生长融合 80% 时,吸出培养液,PBS轻轻洗荡 3 次,参加胰蛋白消化酶 l mL 消化 2 3min 弃胰酶,参加含 10% 胎牛血清的细胞培养基终止消化,用5 mL 移液器吹打,使细胞完全脱落,并吹打混匀.取0.1 mL 消化液

7、,倒置显微镜下观察计数,调整细胞数为5 108/ L,将细胞悬液接种于新的培养瓶中,每24 h 换液一次.细胞分为 3 组: ( 1) 对照组: 正常培养基培养细胞6 h; ( 2) Ang组:含 Ang的培养基( 终浓度为 10- 6mol / L) 培养细胞 6 h; ( 3) Ang +PD98059 组: 含 PD98059 的培养基 ( 终浓度为 10- 5mol / L) 预处理细胞 1 h 后,参加含 Ang的培养基( 终浓度为10- 6mol / L) 培养细胞 6 h. 1. 3 Real Time PCR 检测 HIF-1 、VEGF、PHD2 和FIH-1 基因表示出Tr

8、izol 法提取细胞 RNA,逆转录成 cDNA,以 -actin 为内参行 Real Time PCR,记录 Ct 值,分别检测HIF-1 、VEGF 以及 PHD2、FIH-1 的基因表示出.HIF-1 上、下游引物分别为 5 -TGC TTG GTG CTG ATTTGT GA-3 和 5 -GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA-3 ,产物长度 209 bp.VEGF 上、下游引物分别为 5 -CCT CCG AAA CCA TGA ACT TT-3 和 5 -AGA GATCTG GTT CCC GAA AC-3 ,产物长度 637 bp.PHD2上、下游引物分别为 5

9、 -CTC ACT GAC CTA CGCCGT GT-3 和 5 -CGC ATC TTC CAT CTC CAT TT-3 .FIH-1 上、下游引物分别为 5 -ACA GTG CCAGCA CCC ACA AC-3 和 5 -GCC CAC AGT GTC ATTGAG CG-3 .PCR 条件为: 95 变性 5 min,94 20s,72 20 s,72 5 min,55 10 s,40 个循环.内参 -actin 上、下游引物分别为 5 -GTG GGG CGC CCCAGG CAC CA-3 和 5 -CTT CCT TAA TGT CAC CCACGA TTT C-3 ,产物

10、长度 540 bp,其 PCR 条件为:94 变性 5 min,94 30 s,66 45 s,72 45 s,72 10 min,40 个循环. 1. 4 Western blot 检测 HIF-1 、VEGF、PHD2、FIH-1、ERK 和 p-ERK 的蛋白表示出.分组处理细胞后,弃培养基,PBS 洗2 次,加 RIPA裂解液,冰孵30 min,4 12000 r/min 离心20 min,收取上清液分装于 -80备用.取总蛋白 60 g,100煮沸 5 min,10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转印到 PVDF 膜,5%脱脂牛奶封闭60 min,加一抗( 稀释度11000)

11、,4过夜,HRP 标记的二抗孵育1 h,TBS-T漂洗5 次( 每次5 min) .ECL 试剂盒显影,X 线片扫描后,Image J 图像分析软件分析. 1. 5 统计学分析 数据用x s 表示,SPSS 17.0 软件进行统计分析.多组间比拟用 ANOVA 方差分析,组间比拟用独立样本 t 检验; 双侧 P 0.05 表示差异有统计学意义. 2 结 果 2. 1 HIF-1 、VEGF、PHD2 和 FIH-1 基因的表示出 与对照组比拟,Ang组 HIF-1 、VEGF 基因表示出显着增加,FIH-1 基因表示出降低( P 均 0. 05) ,PHD2 基因表示出无显着变化.与 Ang组

12、比拟,Ang + PD98059 组 HIF-1 、VEGF 基因表示出显着降低,FIH-1 基因表示出增加( P 均 0. 05 ) ,同样 PHD2 基因表示出无明显改变( 图 1) . 2. 2 HIF-1 、VEGF、PHD2、FIH-1 及 ERK、p-ERK 蛋白的表示出 与对照组比拟,Ang组 HIF-1、VEGF 蛋白表示出显着增加,FIH-1 蛋白表示出显着降低( P 均 0. 05) ,而 PHD2 蛋白和 ERK 蛋白表示出无显着变化,但磷酸化 ERK ( p-ERK) 蛋白表示出显着增加( P 0. 05) .与Ang组比拟,Ang+ PD98059 组 HIF-1、V

13、EGF 蛋白表示出显着降低,FIH-1 蛋白表示出显着增加( P 均 0. 05) ,而 PHD2 蛋白和 ERK 蛋白表示出无明显改变,p-ERK 蛋白表示出显着降低( P 0. 05; 图 2) . 3 讨 论 高血压时 Ang与其受体 AT1R 结合后通太多条信号通路促进平滑肌细胞增殖、向内膜迁移,是导致血管阻力增大的原因之一.Ang上调 HIF-1 的表示出后促进 HIF-1 下游靶基因 VEGF 的表示出,在平滑肌细胞增殖中起重要作用.与以往研究一致1,6,我们的结果显示,Ang处理的 HUASMC 中HIF-1 和 VEGF 的表示出均显着增加,讲明 Ang上调 HIF-1 表示出

14、,具有促 VEGF 表示出的作用. HIF-1 是细胞缺氧时被诱导产生的关键因子,通过激活其下游近 100 多种与缺氧相关基因的转录,在缺氧适应性反响和损伤中起重要作用.HIF-1 翻译后水平的调节受氧浓度影响: 常氧时,HIF-1 被氧依靠性与氧非依靠性通路所激活的酶降解,几乎无活性; 细胞缺氧时,堆积在胞浆的 HIF-1 入核,与靶基因 DNA 结合,发挥其转录激活功能. PHD2 是翻译后水平调节 HIF-1 的限速酶,通过羟化 HIF-1 促进其降解7.我们发现,Ang组HIF-1 表示出虽增加,但 PHD2 基因和蛋白表示出无显着变化.根据 Pag 等5研究结果,需考虑 Ang不影响

15、 PHD2 基因和蛋白表示出,但不排除其它因素介入 Ang对 HIF-1 的调节作用. FIH-1 是另一种在翻译后水平通过羟化 HIF-1 而影响其稳态的关键酶.FIH-1 的蛋白表示出在组织细胞中比拟稳定8,对低氧的耐受性比 PHD2 强,0. 2% 的低氧处理可使 PHD2 的羟化作用失活,但FIH-1 的羟化作用仍存在9,缺氧不改变 FIH-1 蛋白的表示出10.有研究表示清楚 FIH-1 的转录活性受PKC 信号通路的影响,活化的 PKC 通过与 FIH-1 基因 DNA 的 CDP/Cut 相结合,可抑制 FIH-1 的转录活性11.结果显示,Ang显着降低 HUASMC 中 FI

16、H-1 基因和蛋白表示出的同时,显着激活 ERK 信号通路,增加 p-ERK 蛋白表示出; 用 ERK 抑制剂 PD98059阻断 ERK 信号通路的活化后,p-ERK 蛋白表示出显着降低,FIH-1 表示出上调,HIF-1 、VEGF 表示出均下降. 提示 ERK 通路对 FIH-1 的影响趋势与 PKC 通路的影响趋势类似: ERK 信号通路激活后磷酸化的 ERK介导 Ang下调 FIH-1 的表示出,使 HIF-1 的降解减少,增加细胞内 HIF-1 蛋白表示出以及 VEGF 基因和蛋白表示出,这可能是 Ang上调 HIF-1 蛋白表示出的机制; 然而 ERK 信号通路介导 Ang下调

17、FIH-1 表示出的详细作用机制有待进一步研究.同时,HUA-SMC 中 HIF-1 基因表示出上调并不能单一地归于FIH-1 表示出下降所致,可能 Ang本身从转录水平上调了 HIF-1 的基因表示出3. 综上所述,我们发现磷酸化 ERK 信号通路介导Ang下调 HUASMC 中 FIH-1 基因和蛋白表示出,该表示出的下调可能是 Ang上调 HIF-1 蛋白表示出的机制之一; ERK 抑制剂削弱了 Ang对 HUASMC 中 HIF-1 、VEGF 表示出的诱导作用.这些结果为防治高血压Ang促血管平滑肌细胞增殖提供了新思路. 以下为参考文献 1Richard DE,Berra E,Pou

18、yssegur J. Nonhypoxic pathway mediatesthe induction of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smoothmuscle cellsJ. J Biol Chem,2000,275 ( 35) : 26 765-771. 2Grlach A,Diebold I,Schini-Kerth VB,et al. Thrombin activatesthe hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway in vascular smoothmuscle cell

19、s: role of the p22 ( phox) -containing NADPH oxidaseJ. Circ Res,2001,89 ( 1) : 47-54. 3Pag EL,Robitaille GA,Pouyss gur J,et al. Induction of hypoxia-inducible factor-1 by transcriptional and translational mechanismsJ. J Biol Chem,2002,277 ( 50) : 48 403-409. 4Su Y,Loos M,Giese N,et al. Prolylhydroxy

20、lase-2 ( PHD2) exertstumor-suppressive activity in pancreatic cancerJ. Cancer,2020,118 ( 4) : 960-972. 5Pag EL,Chan DA,Giaccia AJ,et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha stabilization in nonhypoxic conditions: role of oxidation andintracellular ascorbate depletionJ. Mol Biol Cell,2008,19 ( 1) :86-94.

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