几种单克隆抗体表位的分析方法综述,免疫学论文.docx

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1、几种单克隆抗体表位的分析方法综述,免疫学论文内容摘要：单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性， 已广泛应用于本身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。单克隆抗体与相应抗原的反响性决定于其所辨别的抗原表位， 确定相应表位在抗原构造上的位置是单克隆抗体挑选中的关键步骤。本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方式方法， 包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱 hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS 、生物信息学表位预测方式方法的原理、特点以及研究进展作一综述。 本文关

2、键词语：单克隆抗体； 抗原表位； 酶联免疫吸附试验； 噬菌体随机肽库； X-射线晶体学； 丙氨酸扫描； 氢氘交换质谱； 生物信息学； 单克隆抗体技术的出现不仅促进了免疫学的发展， 也促进了很多其他学科的发展， 该技术广泛用于医学领域， 已成为重要的临床诊断手段和有效的药物治疗方式方法1, 十分是治疗性单克隆抗体已成为最近几年来生物制药业发展最快的领域之一2, 同时， 也为一些新技术提供了基础平台， 如抗体偶联药物3、双特异性抗体4及新兴的CAR-T细胞治疗5-6.由于单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性， 极大改变了医学实践， 提高了病患的生存质量， 拯救了更多患者的生命。单克

3、隆抗体作为一种治疗恶性肿瘤和炎症性疾病的被动免疫制剂进入临床使用， 再进一步发展至其他领域， 包括神经系统疾病 如阿尔兹海默病等 及本身免疫疾病 如红斑狼疮等 7. 抗体功能取决于其与靶抗原结合的表位， 表位是抗原的一部分， 与抗体的可变区结合， 与不同表位结合发挥特定的功能， 这些功能可能表现为抑制活性或激活某个信号等。单克隆抗体的表位分析能促进抗体治疗的发展， 指导疫苗的设计， 评估免疫者体内保卫性抗体的反响， 或是定位抗菌剂作用于病原微生物的靶点8.单克隆抗体与相应抗原的反响性决定于其所辨别的抗原表位， 确定相应表位在抗原构造上的位置是单克隆抗体挑选中关键步骤9.同时， 可进一步分析这类

4、表位的差异， 正确评价单克隆抗体的特异性和穿插反响性， 可用于评价某抗原表位是某种菌株不同血清型的共同表位， 还是特异表位。 随着抗体技术的发展， 抗原表位分析显得尤为重要， 本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方式方法， 包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱 hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS 、生物信息学表位预测方式方法的原理、特点以及研究进展作一综述。 1 ELISA法 ELISA法操作简便， 是单克隆抗体表位分析最常用的方式方法。本文主要介绍ELISA法中

5、最常用的两种：ELISA相加试验和竞争抑制试验 c ELISA .这两种方式方法的基本原理均为双抗体竞争， 可用于进行大批单克隆抗体的系统挑选。相加试验采用了高效价的酶标二抗作为指示系统， 重复性和敏感性均较良好；c ELISA法也较精到准确， 但需对待检的一株或数株单克隆抗体进行纯化和标记。 1.1 ELISA相加试验 该方式方法首先将抗原分别与两种单克隆抗体作饱和曲线， 确定能使抗原饱和的适宜抗体浓度， 分别将第1种、第2种饱和浓度及两种饱和浓度的单克隆混合物与该抗原结合， 测定相应A450, 分别为A1、A2及A1+2, 通过A值得到相加指数 AI , 公式为AI % =2 A1+2/

6、A1+A2 -1 100%.如单克隆抗体浓度可将抗原饱和， 当两种单抗针对一样表位时， AI将趋近于0, 两种抗体的表位不同的， AI将接近100%, 结果一般以AI 或 50%进行断定。FRIGUET等10初次使用该方式方法来鉴别两种单抗辨别的表位能否一样， 实验检测了7种不同的抗大肠埃希菌色氨酸合成酶 2亚基单克隆抗体， 首先用纯化抗原包板， 再将两种抗体分别或同时参加， 结果表示清楚， 华而不实5株单抗辨别一样表位， 其他2株辨别其他表位。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C Cys C 是一个优良的肾功能标志物， 尤其在评价早期急性肾损伤方面。ZHA等11首先挑选4种杂交瘤细胞系来获得Cys C单

7、克隆抗体， 通过ELISA相加试验发现， 有4组单抗的AI 50%, 辨别不同的表位， 2组单抗的AI值 50%, 辨别一样的表位。CAO等12通过ELISA相加试验证实， 抗羊白介素-18单克隆抗体2E8和4C4针对不同表位。SHI等13对抗丙型肝炎病毒 hepatitis C virus, HCV 单克隆抗体进行表位分析， 再将4种抗体分为6组进行相加试验， 发现3组AI值 50%, 辨别不同表位。 1.2 c ELISA法 实验时， 抗原包板后同时参加未标记的待检单克隆抗体和酶标的对照单克隆抗体， 当两种单克隆抗体的表位特异性一样时， 酶标对照单克隆抗体与待检单克隆抗体发生竞争， 进而出

8、现抑制现象。通过检测A450计算抑制率， 计算方式多样， 仅列出3种：抑制率 % = A基点对照-A抑制 /A基点对照 100%、抑制率=log2 A抑制/A基点对照 、抑制率 % = 1-A抑制 /A基点对照 100%, 华而不实A基点对照为酶标对照组， 不加任何竞争抗体；A抑制为两种单抗存在时的测量值。当酶标对照单抗无其他竞争抗体时， A值为最大， 计算结果越接近100%, 讲明两种抗体辨别的表位越接近；越接近0, 讲明两种抗体辨别的表位相关性越小。 KOBAYASHI等14用重组戊型肝炎病毒蛋白 HEV ORF2-G4 包板， 再将生物素化的单克隆抗体及未标记的单克隆抗体在PBS-BSA

9、中预先混合后参加板中， 辨别乙肝病毒的单克隆抗体作为阴性对照， 反响结束后测定A450.通过公式抑制率 % = 1-A抑制 /A基点对照 100%来计算抑制率， 经9株单克隆抗体的竞争ELISA试验表示清楚， H6206、H6219、H6222、H6235、H6242和H6253这6株抗体中， 标记1种抗体， 分别参加其他5种抗体时， 抑制率在71.2%100%之间， 生物素化抗体与抗原的结合几乎完全被抑制， 表示清楚6株抗体辨别一样或重叠表位；另外3种抗体H6210、H6225和H6249中， H6210可部分抑制生物素化的H6225和H6249, 抑制率分别为38.0%和27.4%, H6

10、225与生物素化的H6210和H6249的抑制率分别为54.2%和52.5%, H6249与生物素化的H6210和H6225的抑制率分别为55.4%和48.3%, 表示清楚H6210、H6225和H6249抗体可能辨别不同， 但空间位置相关的表位。YU等15通过一组c ELISA试验评估单克隆抗体 包括20种人单克隆抗体和11种鼠单克隆抗体 与新布尼亚病毒 severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV N蛋白表位的结合特异性， 用抗原包板后， 参加人或鼠单克隆抗体和HRP标记的单克隆抗体， 通过检测A450计算抑制率

11、， 公式为：抑制率 % = A基点对照-A抑制 /A基点对照 100%, 选择Western blot试验中蛋白带为阳性的抗体为HRP标记抗体， 共20种人单抗和11种鼠单克隆抗体作为竞争抗体， 根据抑制率揣测， N蛋白上至少有4个不同的结合表位。 ZHAO等16通过c ELISA对23株抗HEV单克隆抗体进行表位分析以提高对表位空间构型的理解， 这组单克隆抗体均辨别HEV的E2s构造域。该实验是用HRP标记单抗， 通过公式抑制率=log2 A抑制/A基点对照 计算抑制率。实验通过23 23c ELISA得到了大量的数据， 并用SPSS 18.0软件对数据处理进行表位分类。与传统的c ELIS

12、A数据分析不同， 单克隆抗体之间的抑制率并不是以百分比表示， 而是转换为-40间的值 与抑制率093.7%一致 , 该方式方法具有更高层次直观性和精到准确性， 并能高效分析数据。该方式方法定义了两种参数：blocking参数用来描绘叙述一种单抗对其他23种单抗 包括此抗体本身 的抑制能力；blocked参数代表一种单抗被其他单抗抑制的程度。每种单抗通过实验可得到46个参数， 通过这两种参数来描绘叙述每种单克隆抗体表位与其余22种单克隆抗体表位的空间关系特征。单克隆抗体之间的类似程度使用树状图描绘叙述， 单克隆抗体间距以125之间的数字表示， 值越小表示单克隆抗体表位间的距离越近， 反之则距离越

13、远；距离值 5有类似的图像描绘叙述， 则归为同一类， 由此断定23种单抗可分为6类， 表示清楚HEV衣壳蛋白E2s构造域至少由6种不用构象依靠的表位组成。 2 生物酶解法及化学切割法 生物酶解法及化学切割法为传统的表位分析方式方法， 是通过化学或生物处理抗原分子以获得长短不同的多肽片段， 再利用单克隆抗体挑选可与其发生阳性反响的片段， 分析阳性片段的氨基酸序列后合成该序列， 进而确定起关键作用的单个氨基酸。TRUDEL等17通过分析呼吸道合胞病毒 respiratory syncytial virus, RSV 的化学切割和酶解产物， 得到了抗RSV单克隆抗体辨别的表位， 主要位于中和表位上一

14、个相对分子质量7 000的裂解片段。 该方式方法合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位， 因而不适用于构象表位 完好蛋白质的抗原表位中， 90%是构象表位， 仅10%为线性抗原表位 , 构象表位会被切割、変性条件及表位本身的裂解所影响， 使原有的构象发生改变18-19.由于费时费力， 且对抗原表位的类型要求严苛， 这种表位分析方式方法的应用并不广泛。 基于该原理还有另一种方式方法， 根据揣测的抗原表位区域， 通过基因工程手段将该区域的多肽截短表示出， 相邻点的肽序列互相重叠， 以确保连续呈现， 再采用ELISA和Western blot法检测单克隆抗体与不同截短表示出蛋白的的反响来推知不同单抗辨别

15、的表位区域， 这种方式方法的工作量较大， 主要筛查的也是线性表位。HAMAOKA等20将肝素结合表皮生长因子多肽截短表示出为6段， 通过ELISA法检测8种单克隆抗体与截短肽段的结合情况， 共得到3种不同的结果， 讲明8种单克隆抗体至少辨别3种不同的表位。WEBER21等将组织蛋白原B基因序列截短合成后通过Western blot检测， 结果表示清楚， 待测抗体辨别出5个不同的表位。 3 噬菌体随机肽库 1990年， SCOTT等22初次将噬菌体多肽库应用于挑选抗原表位， 自此， 国内外学者进行了大量的相关研究。 组合噬菌体文库是高通量挑选蛋白质互相作用的有力工具， 在所有可用的分子显示技术中

16、， 噬菌体展示技术是最常用的方式方法23.噬菌体展示技术是一种基因表示出产物与亲和选择相结合的技术， 这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA序列插入至噬菌体颗粒外壳蛋白的一个构造基因的适当位置， 外源基因随外壳蛋白的表示出而表示出， 被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间构造和生物活性， 通过反复的亲和选择和扩增， 可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物活性并分离出带有目的基因的噬菌体。 从噬菌体随机肽库中挑选抗原表位的基本原理是生物淘选， 利用单克隆抗体挑选蛋白质抗原表位， 获取抗体亲和性模拟肽， 对模拟肽集合进行比对处理， 获得探针基序， 然后利用探针基序在抗原蛋白外表搜索最佳匹配的

17、氨基酸序列， 获得的序列即作为预测结果。该方式方法是基于目的单克隆抗体对噬菌体展示短肽的亲和选择24-25.详细操作程序为：在聚乙烯板上包被单克隆抗体， 再参加噬菌体肽库， 使其充分反响， 洗去未结合的噬菌体， 使已结合的噬菌体洗脱下来， 将其感染的大肠埃希菌扩增后回收， 再次与已包被单克隆抗体发生反响， 进行下一轮挑选26.一般通过3、4轮挑选可获得与单克隆抗体结合较严密的噬菌体颗粒。通过DNA序列分析， 能定位该噬菌体克隆所携带的外源肽序列， 进而可知该单抗所辨别的抗原表位序列。 HE等27利用噬菌体随机肽库方式方法研究抗牛痘病毒抗原A33单克隆抗体 MAb-1G10 辨别的表位， 通过实

18、验得到了表位的构成及结合的关键残基。包膜糖蛋白E2和Erns是猪瘟疫病毒与细胞外表受体作用的媒介， ZHANG等28使用噬菌体展示技术研究单克隆抗体辨别E2和Erns的表位， 结果显示， 两株E2特异性抗体有共同的结合模拟肽， 该肽序列与E2蛋白的华而不实一段序列类似；两株Erns特异性单克隆抗体也有共同的结合模体， 华而不实一种单克隆抗体存在另一种不同的结合模体。高源等29以白介素-15 interleukin-15, IL-15 单克隆抗体为靶分子， 对噬菌体7肽库进行了3轮体外生物淘选， 再通过ELISA法鉴定第3轮洗脱下来的噬菌体， 挑选了15种与IL-15单克隆抗体结合力较强的噬菌体

19、， 再将这15个克隆进行DNA序列测定， 得到4组7肽序列， 并通过噬菌体ELISA和c ELISA法证明了4组多肽结合的特异性。 噬菌体肽库技术解决了传统挑选方式方法只能获得抗原线性表位的问题， 该方式方法不仅能确定抗原的线性表位， 且可分析构象表位。对于不连续的抗原表位， 只能通过噬菌体短肽库获得模拟表位， 这些模拟表位虽能特异性结合抗体， 但氨基酸序列与天然蛋白质的氨基酸序列不完全一样， 需进一步结合抗原构造分析的资料来明确。 4 X-射线晶体学 X-射线分辨单克隆抗体-抗原复合物是分析单克隆抗体辨别表位的最可靠方式方法， 该方式方法基于对单克隆抗体-抗原共晶体衍射的X-射线束的强度和角

20、度测量， 再用生物信息学的方式方法确定原子坐标， 将复合体的三维构造完好可视化30-31. N62是土拉弗朗西斯菌的单克隆抗体， LU等32通过单克隆抗体N62的Fab段X-射线晶体构造显示， 抗原结合区域是由芳香族氨基酸组成， 芳香族氨基酸构成了一个小的凹处， 包容不超过4/3个糖残基， 表示清楚N62主要与土拉弗朗西斯菌O抗原非复原端末端的Qui4NFm残基结合。Mnt C是金黄色葡萄球菌转运蛋白， 当前， 正在对作为金黄色葡萄球菌疫苗的组分进行研究， GRIBENKO等33应用X射线晶体学分析Mnt C与其单克隆抗体305-78-7的复合体， 结果显示， 305-78-7与Mnt C的C

21、-末端小叶结合， -helix 8和 -sheet 8组成了抗原抗体的主要接触面， 另外， Mnt C的E247可能与抗体重链上的K58构成了盐桥。 应用该方式方法首先需获得纯度较高的抗原、抗体， 并使其互相作用构成共晶， 但由于成本及技术要求较高， 难以建立结晶条件， 某些细菌或病毒蛋白产量过低等原因， 此方式方法并未广泛使用。 5 丙氨酸扫描 丙氨酸扫描法的原理是在抗原氨基酸主要序列模板上引入丙氨酸突变后， 对可能影响单克隆抗体与抗原结合的氨基酸改变进行评估以确定表位的位置。用丙氨酸进行突变是由于其相对分子质量小且带电荷为中性， 某些情况下， 如表位已包含丙氨酸或是有糖基化位点存在时， 可

22、用其他氨基酸进行突变34.在不同氨基酸位置构成丙氨酸突变后， 所有携带丙氨酸突变的蛋白质可用结合实验来检测， 与未进行突变之前的结合比拟， 若突变体显示与单克隆抗体结合力变低， 那么其携带的突变可能介入单克隆抗体的结合， 由此可推断该突变位置可能是单克隆抗体表位的一部分35.但突变分析方式方法并不合适常以多聚体形式出现的抗原， 表位氨基酸突变可能引起表位构造的改变， 进而导致抗原失去多聚体形式或完全不表示出36. KECK等37通过对HCV的H77C E2区进行丙氨酸扫描突变分析， 将4株单克隆抗体HC33.4、HC33.8、HC33.29、HC33.1.的HC表位限定于aa 411446,

23、实验表示清楚， 这些单克隆抗体与位于L413、G418和W420处的残基无法结合。在这里基础上， KECK等38对E2区域的aa 384466 包含了完好的高变区1的范围 进行丙氨酸扫描突变， 将E2突变体在HEK293T细胞中表示出后， ELISA法检测与4种单克隆抗体的结合情况， 结果表示清楚， 4株HC33相关单克隆抗体与L413A、G418A和W420A突变体的结合降低了80%以上；华而不实3株抗体与K408A突变体的结合降低80%, 另1株抗体与K408A突变体的结合未见明显降低。进而得出结论：这4株抗体可被分为两类。 6 HDX-MS HDX-MS是一种研究蛋白质-配体互相作用和蛋

24、白质-蛋白质互相作用的方式方法39, 该方式方法的基本原理是：将蛋白质浸入重水中， 蛋白质外表与重水密切接触的氢比蛋白质内部的氢交换速率快， 一旦两种蛋白质相互绑定， 溶剂就无法接触到其互相作用的界面。将该原理反映至氢氘交换动力学上， 通过质谱即可得到结合或不结合单克隆抗体时抗原包含的氘量。尽管该方式方法的应用存在一些变化， 但主要包括6个步骤：用包含氘的溶液处理抗原、处理好的抗原与目的抗体结合、水洗氘-抗原-抗体混合物以进行离子交换、用低p H缓冲液洗脱抗体、抗原洗脱后经胃蛋白酶消化、质谱检测40.检测结束后， 用生物信息学的方式方法分析包含了氘的抗原片段， 在蛋白质数据库中找到与抗原晶体构

25、造一致的构型。 f Hbp是脑膜炎双球菌的关键毒力因子， 其在脑膜炎球菌的发病机制中起重要作用， 可将人类因子H hf H 招募至细菌外表以保卫细菌不经补体介导而死亡。MALITO等41通过HDX-MS分析f Hbp与其单克隆抗体12C1的结合表位， 结果显示， 在12C1存在时， 19个f Hbp片段中， 7个的H-D交换发生减少。这些部分重叠肽可定义4个不连续区段， 包含了分布在f Hbp N和C-末端构造域的92个残基， 并聚集在不同区域。PRADZIN SKA等42通过HDX-MS分析了人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C h CC 单体蛋白与其单克隆抗体Cyst10及Cyst28结合的情况， 结

26、果显示， Cyst10辨别分别位于h CC两个环装构造的两个片段；Cysr28辨别的表位分为4个部分， 华而不实3个片段位于 股内， 第4的片段包含了L1环的序列。 7 生物信息学表位预测 最近几年， 基于生物信息学的表位预测显着促进了疫苗的发展， 也有很多预测软件已成功在病毒表位预测中使用。表位根据其受体的不同分为两类：一类为T细胞表位， 由T细胞受体辨别；另一类为B细胞表位， 由B细胞或抗体辨别， B细胞表位分为连续的线性表位和非连续的构象表位， 且以构象表位为主。与T细胞表位预测相比， B细胞表位预测更复杂， 尤其是构象表位， 除了序列之外， 还要考虑蛋白质的3D构造。在本文中主要阐述与

27、单克隆抗体表位分析相关的B细胞表位预测。 表位预测方式方法中最基本的假设是：同种病毒中存在进化关系， 且序列分析可发现华而不实保守序列或构造。已开发的预测算法均是基于抗原的主要氨基酸序列、3D构造或蛋白特性诸如亲水性、易接近性和柔韧性。预测工具43主要有下面几种：e Pitope、Bcepred、ABCpred、Discotope、Bepi Pred及CEP等， 每种软件在精到准确性、特异性和敏感性方面有所不同。 MAHDAVI等44用生物信息学的方式方法预测了人类表皮生长因子2胞外构造域子域 HER 2ECD-Subdomian 的B细胞线性和构象表位， 该研究初次对HER 2 ECD-Su

28、bdomian新的B细胞构象表位进行了鉴定。使用了ABCpred、BCPREDs、Bepired、Bcepred和Elliprro来预测线性表位；Discotope、CBtope和SUPERFICIAL对构象表位进行预测。DENISOVA等45同时应用突变分析和表位预测来研究抗西尼罗病毒 West Nile virus E蛋白单抗辨别的表位， 实验中， 两种方式方法展现了良好的互补性， 为表位特征描绘叙述提供了稳固的平台。 由于这些预测方式方法是经电脑模拟， 省时且成本低， 常作为抗原表位鉴定的辅助工具在具体实验研究前使用。当使用此类方式方法时， 要认识到当下软件的局限性， 人们对免疫系统认知

29、不完全和预测方式方法的近似性致使不可能存在一种精到准确的算法， 另外， 不同的工具也许会产生不同的结果， 应使用多种预测工具来确保结果的一致性。 8 小结 当前， 单克隆抗体主要用于癌症治疗、本身免疫疾病的免疫调节治疗、移植排挤反响和移植物抗宿主疾病等， Daratumumab是一种新的高亲和力的治疗性单克隆抗体， 用于治疗多发性骨髓瘤， 其以独特的CD38抗原表位为靶分子， 丰富的临床前数据支持了其在联合治疗中的使用， 且各种组合使用的临床研究正在进行中46.Tregalizumab是第一个人源化抗CD4单克隆抗体， 能选择性诱导调节性T细胞 Tregs 的活化， 与CD4上一个独特表位结合

30、， 用于治疗类风湿性关节炎47.IWAMOTO等48通过细胞结合试验分析， 得出抗肝素结合表皮生长因子 HE-EGF 单克隆抗体2-108辨别HB-EGF的N-末端前导肽区域， 结果表示清楚， 该单克隆抗体将在HB-EGF相关癌症的诊断、基础和临床研究中发挥作用。单克隆抗体也将用于感染性疾病的治疗， 包括真菌感染和细菌感染49, 考虑到抗感染药物使用广泛， 易造成毒副作用， 因而选择靶向微生物病原体的药物是研究和临床应用的关键。 单克隆抗体是当前临床使用量增长最快的治疗药物之一， 适应证广泛， 尽管如此， 与传统的多克隆抗体制剂相比， 单克隆抗体的效力仍相对较低， 另外， 仅用一种中和性单克隆

31、抗体， 其效力可能会由于表位的突变遭到抑制。为提高用药效力、扩大特异性， 还可将对靶抗原有不同特异性的单克隆抗体进行混合， 这种混合单克隆抗体可能会出现协同作用， 其效力超过每种单克隆抗体效力之和。这需对不同的单克隆抗体进行表位分析来判定其结合的表位能否一样， 甚至完全明确其结合的表位序列。单克隆抗体鸡尾酒药物CL184由两种针对不同表位的单克隆抗体混合而成， 用于狂犬病的暴露后预防50, 另外， 还有一些处于研究阶段的此类药物， 包括用于流行性感冒51、炭疽52和癌症53等。ZMappTM由3种单抗混合， 这3种单抗分别结合埃博拉病毒 Ebolavirus, EBOV GP抗原的不同表位，

32、数个病患用药后身体状况得以改善54-56.单克隆抗体作为治疗和诊断使用须进行仔细的挑选， 以挑选出辨别目的抗原特定表位的抗体， 这样使抗体到达预期生物功能57. 以下为参考文献 1HAN L N, HE S, WANG Y T, et al.Advances in monoclonal antibody application in myocarditisJ.J Zhejiang Univ Sci B, 2020, 14 8 :676-687. 2REICHERT J M.Antibodies to watch in 2021J.MAbs, 2021, 7 1 :1-8. 3PETERS C,

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