疾病遗传易感性研究方法的历史、原理及进展,医学遗传学论文.docx

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1、疾病遗传易感性研究方法的历史、原理及进展,医学遗传学论文摘 要： 遗传易感性是指基于个人遗传背景的多基因遗传病发病风险,即来源于父母一方或双方的特定遗传变异在某些情况下会诱发疾病。在特定疾病的发病机制中某些高外显率的遗传变异发挥重要作用,此类疾病通过患病家系分析即可定位疾病相关遗传变异;但另一些低外显率变异的作用则不明显,需要大规模患病人群分析来解析遗传机制。近年来,随着二代测序和多组学分析技术的发展和基因组数据的大量积累,癌症、代谢性疾病、心脑血管疾病和精神疾病等疾病遗传易感性研究中获得了显着进展,为疾病的早期筛查和诊断治疗提供了参考。 本文关键词语： 遗传易感性; 分析方式方法; 基因型;

2、 表型; Abstract： Genetic susceptibility refers to the risk of developing polygenetic diseases based on personal genetic background, that is, specific genetic variation from one or both parents can induce disease in some cases. The genetic variations of high penetrance play important roles in the patho

3、genesis of specific diseases, in which associated genetic changes can be identified through pedigree analysis, while effects of these variations with low penetrance are hard to determine, requiring large-scale population analysis to investigate the responsible genetic mechanism. In recent years, wit

4、h the development of second generation sequencing and multifactorial analysis techniques as well as the accumulation of genomic data, significant progress has been made in the study of genetic susceptibility to diseases such as cancer, metabolic diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases,

5、 and mental diseases,which provides a reference for early screening, diagnosis, and treatment of human diseases. Keyword： Genetic susceptibility; Research method; Genotype; Phenotype; 随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的开展,人们对于基因组变异和疾病的认识也越来越深切进入。人类基因组上的变异主要分为三种:单核苷酸变异(SNP)、小片段序列的插入或删除(Small Indel)和大片段的构造性变异(SV)。任何

6、一种变异都可能会引起个体的表型或特征发生改变甚至引起疾病。 根据基因变异-疾病的关系能够将人类疾病分为三类。第一类是单基因遗传病(Monogenic disease),仅一对等位基因的改变就会引发疾病并能够遗传给后代1,如血友病2和白化病3。固然每种单基因遗传病的发病率很低,但由于种类诸多(约5 0008 000种),总发病率高达6%1。第二类是多基因疾病(Multigenic/polygenic disease),也称为复杂性疾病(Complex disease),是牵涉两个或两个以上的基因且通常和多种环境因素共同作用导致的疾病4,如肿瘤5和糖尿病6等。第三类为获得性基因病,主要是由病原微生

7、物通过感染将其基因入侵到宿主,导致宿主基因组改变,如艾滋病、HPV感染及乙型肝炎等。 遗传易感性研究通常关注的是与人类疾病相关的基因组变异,主要研究方式方法有基于家系的连锁分析(Linkage analysis)、关联分析(包含候选基因关联分析(Candidate gene association study)、全基因组关联分析(Genome-wide association study)和基因集合关联分析(Gene set analysis)等。本文将介绍各种遗传易感性研究方式方法的历史、原理及进展。 1、 基于家系的连锁分析 连锁分析研究的理论基础是疾病家系中致病的基因或者染色体区域与疾病

8、性状共分离(Co-segregation),因而连锁分析主要应用于单基因疾病研究。两个在基因组上位置相邻的基因座上的等位基来由于连锁而共同分离,因而更容易作为一个单位共同遗传给后代。因而,患病个体除携带致病性变异外,还会表现出携带与致病变异连锁的遗传标记位点(单核苷酸多态位点或微卫星序列)。通过分析患者中分享的遗传标记位点即可实现对于致病变异的定位7。由于来自一个家庭中父方或母方的共分离现象可能仅限于在这里家庭内部,因而连锁分析必须有患病家庭的数据。基于家系的连锁分析有主要分为参数分析法、非参数分析法和核心家系法。 1.1、参数分析法 参数分析法(又称基于模型分析法)是家系研究的传统方式方法,

9、主要通过最大似然法(Maximum-likelihood analysis)和LOD值8来检测待研究的家系的遗传形式能否符合一个已经知道影响表型的基因的遗传形式(Mode of inheritance,MOI)8,9。LOD值于1955年由Morton初次提出10,计算的是在一个家系中,两个基因座按一定重组率( 值)进行连锁遗传的可能性L 与不连锁遗传的可能性L0.5之比,具体表现出为优势比的对数。公式如下: Z( )=LOD=log10L L0.5=log10(1? )NR R0.5(NR+R) 华而不实NR指不连锁的子代数量,R指连锁的子代数量。参数0.5指的是根据孟德尔的自由组合定律,在

10、随机情况下任何两个完全不连锁的基因座都有50%的重组率。当LOD值 3,即连锁的可能性与不连锁的可能性之比大于等于1 0001时,能够以为这两个基因座在该家系样本中是连锁的8,11,对应的p值为小于等于0.0512。 1992年,Schellenberg等人应用该方式方法鉴定了位于14染色体的ApoE4与家族型阿尔兹海默病连锁13。随后多项研究表示清楚,ApoE4会显着增加阿尔兹海默病的风险。携带一个ApoE4拷贝会增加23倍患病风险,而携带两个拷贝患病风险会增加12倍14。病理学研究结果表示清楚,携带ApoE4人群的大脑中积聚着更多的 淀粉样蛋白斑块,会阻断神经元-神经元信号15。除此之外,

11、应用参数方式方法鉴定的与疾病连锁的基因位点的例子还包括家族非髓性甲状腺癌16、家族型鼻咽癌17及冠心病18等。 1.2、 非参数分析法 基于模型的参数分析法需要预先获得所研究性状的遗传形式、牵涉的等位基因数量及外显率,因而前期模型的错误预设对结果的影响非常大。为了解决参数分析法对预设参数极度敏感的难题,Weeks和Lange于1988年提出了连锁分析的另一种研究方式方法 非参数分析法(又称非基于模型分析法)19,检测的是该家系的遗传形式能否背离了预期的自由组合形式9,能够应用于无法预知疾病的遗传形式或无法获取足量的家庭成员数据的情况。非参数方式方法的原理是通过状态同源(IBS,identica

12、l by state)和血缘同源(IBD,identical by descent)来进行等位基因共占(Allele sharing methods)分析20,21,22,23。IBS指一段DNA片段的序列在两个或多个个体中完全一致;若该IBS片段是遗传自同一个共同祖先,则该片段是IBD。IBD的片段同时也是IBS的,但是IBS的片段不一定都是IBD,还可能是由于突变或重组导致序列完全一致。非参数方式方法通过患者同胞对(ASP,affected sib pairs),患者亲戚对(ARP,affected relative pairs)和家系患者(APM,affected-pedigree-me

13、mber)24,25三种设计来检测患病家系中患病和未患病个体的基因位点类似的程度,并判定导致疾病的位点与测到的位点能否连锁。非参数方式方法的优点是研究对象相对容易收集,但检验效能相对较低且样本量要求较大。 一项研究在123对慢性淋巴细胞性甲状腺炎同胞对中,使用非参数ASP方式方法鉴定了基因组上与本身免疫疾病连锁的5q31-q33区域和与慢性淋巴细胞性甲状腺炎连锁的8q23-q24区域19。除此之外,应用ASP鉴定的疾病连锁位点有白血病23等;应用ARP鉴定的包括系统性红斑狼疮26和炎症性肠病27等疾病;应用APM的研究主要有阿尔茨海默病28,29等。 1.3、 基于核心家系的研究方式方法 复杂

14、疾病遗传易感性的分析最常用的方式方法是在人群中随机选取的病例-对照法,但是由于样本人群可能遭到年龄、性别、种族或地域等因素而造成人群分层30,进而对研究结果造成影响。家庭成员之间的遗传背景类似,因而使用患者核心家系(Nuclear family)作为样本进行基于家系的病例-对照研究能够避免样本分层造成的影响31,32。核心家系(又称三体家系)由一对夫妻及其至少一名患病子女构成33,常用的研究方式方法是家系传递连锁不平衡检验(Transmission disequilibrium test, TDT)31。TDT方式方法是在家系内进行相关分析,观察双亲(至少一个为杂合子)将与候选致病位点连锁的等

15、位基因位点传递给患者子代的概率能否明显增高而呈现出连锁不平衡。与非参数分析方式方法相比,TDT方式方法能够研究位点与发病程度的关系及基因间的互相作用,比方应用TDT方式方法解决了胰岛素基因与IDDM能否相关的问题31。除此之外,由于核心家系只需包含一个患病子代,因而到达同样的检验效能所需的样本量比非参数分析法大大减少。但缺点是晚发型疾病的患者不易获得其双亲的数据,且部分携带疾病易感基因的个体因外显不全而易被错误定为不患病个体。因此很多研究者提出了改善TDT的方式方法,比方Curtis提出以不患病同胞作为对照34。 核心家系能够用来鉴定多种疾病相关的基因和位点。例如,一项欧洲系统性红斑狼疮家系研

16、究选取了103例核心家系及C1q 基因的 5 个tag-SNP进行分析,发现C1qA和 C1qC 与系统性红斑狼疮显着相关35。除此之外,当前研究新生突变的主要方式方法是收集核心家系成员的全基因组测序数据,通过比拟父母与子代基因组的差异来寻找新生突变36。这种研究策略要求测序覆盖度足够大(大于30X),来避免测序中的抽样误差37。2021年解密发育障碍研究计划(The Deciphering Developmental Disorders Study)收集了100 6个核心家系,鉴定了12个新生突变与个体生长发育疾病相关38。 基于家系的连锁分析方式方法需要大量、完好且准确的家系样本数据,在实

17、际研究中具有较大的局限性,而且无法用于分析复杂疾病。随着二代测序技术的发展,研究者们开发了更有效的新方式方法来替代基于家系的连锁分析方式方法。 2 、关联分析研究方式方法 关联分析(Association study)是一种基于群体而非家系的研究方式方法,原理是通过分析在病例和对照中频率有显着差异的等位基因,来鉴定与疾病或性状相关的易感基因和位点。关联分析能够挑选与疾病或性状相关的位点,但两者的因果关系无法揣测39,40。1996年Lander提出了常见变异导致常见疾病假讲(Common Disease/Common Variant,CD/CV)41。该假讲揣测所有患有特定疾病或带有特定表型的

18、个体的基因组均有来自于一个共同祖先的常见变异。这些变异对疾病和表型的作用表现为累加效应或倍乘效应。根据该假讲,疾病易感性是来源于某些特定的常见变异位点,这些位点在患者人群中的频率显着高于未患病人群。该假讲适用于2型糖尿病相关的PPAR 基因42和阿尔兹海默病相关的APOEε4基因43。当前常用的关联分析方式方法有候选基因关联分析和全基因组关联分析两种。 2.1、 候选基因关联分析 候选基因关联分析通过分析候选基因中的tag SNP或者候选SNP在病例样本和对照样本中等位基因的频率,挑选出在统计学意义上具有显着频率差异的位点作为与疾病相关的位点。候选基因关联分析最重要的是样本人群

19、和候选基因的挑选。病例和对照人群应选择具有类似遗传背景的样本,这样频率差异显着的位点才确实与疾病相关。候选基因位点能够通过下面几个途径挑选:(1)首先根据被研究的疾病(性状)的发病机制,选择可能相关的基因;再挑选可能会调控该基因或者编码蛋白的SNP(通常为标记SNP,即tag SNP)44,45;(2)通过全基因组关联分析挑选的与疾病相关的基因和位点,然后将这些候选基因位点在另外一个人群中进行验证46;(3)将其他形式生物(如小鼠模型)的研究结果中与疾病相关的基因和位点作为候选基因,在人类疾病样本中研究其同源基因的关联性47。 最早使用候选基因关联分析法定位的疾病关联基因的例子是1983年基因

20、APOC3(Apolipoprotein C3)上的位点被发现与高甘油三酯血症和动脉粥样硬化相关48。随后,Kim等人使用比拟基因组学和染色体遗传方式方法发现了与人类和猪肥胖特性相关的基因49。通候选基因关联分析还在108例藏族人样本中发现了EDAR基因的位点与血氧饱和度及血小板数量相关,提示EDAR基因对藏族人的高海拔低氧环境适应有正向的奉献50。 2.2、 全基因组关联分析 全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)是在具有不同特性的人群中进行全基因组水平的关联分析的方式方法。与候选基因关联分析不同,全基因组关联分析针对的是所有的遗传位点。2

21、0世纪90年代末,全世界开场大规模构建生物样本数据库。世界各地的研究者都能够上传或获取数据库中的样本和基因组数据,使得样本收集的成本和难度大幅下降51。2003年完成的人类基因组单体型图(HapMap Project)计划52为全基因组关联分析研究使用的绝大多数SNP位点提供了单体型信息。基于以上因素及全基因组分型芯片技术的发展,全基因组关联分析成为了鉴定复杂疾病或性状研究中最常用的方式方法。 全基因组关联分析的经典步骤为:(1)发现与疾病或性状显着相关的位点;(2)在扩大样本中重复发现关联位点;(3)精细定位;(4)通过功能分析验证候选位点53。华而不实第一步发现候选位点为最关键的步骤。一个

22、位点的致病风险通常用优势比(Odds Ratio)来代表,指的是携带该位点中一个等位基因的样本的患病概率和不携带该等位基因的患病概率的比值。当病例组样本中等位基因频率高于对照组样本时,优势比大于1,因而能够通过统计检验优势比能否显着大于1来挑选与疾病显着相关的位点及等位基因。当分析的SNP数量多达数十万个的情况下,一般选择5 10-8作为p值显着的阈值54。第二步扩大样本验证是为了去除第一步发现的假阳性位点,通常在更大规模的疾病-对照样本中将发现的相关位点进行候选基因关联分析55。此时由于只针少数的候选基因位点进行分析,所以P值阈值能够不受限制(通常为0.05或0.01),样本数可以以极大的增

23、加。 全基因组关联分析当前已经得到了非常广泛的应用。根据NHGRI-EBI GWAS Catalog的统计,截止到2022年4月6日,已发表了3 923项全基因组关联分析研究并发现了134 705个关联性。 2.3 、基于关联分析的其他研究方式方法 关联分析通常是针对一组病例-对照样本进行逐个位点的卡方检验。为了发现更多的候选位点及微效基因位点,研究者基于单点单组样本关联分析又开发了多种研究方式方法,比方imputation、meta-analysis、上位效应研究(Epistasis)和基因集合关联分析(Gene set analysis,GSA)。 运用imputation,能够基于已经知

24、道的基因型(如国际人类基因组单体型图计划56和千人基因组计划57来预测缺失位点的基因型,使得用于分析的位点数大大增加,进而实现对于易感性位点的精细定位。而meta-analysis则能够将多个关联分析的结果进行整合分析,保证微效位点的有效检出。 人们发现大多数数量性状受多个位点共同作用的复杂性状58,因而发现更多的微效位点及位点之间的互相作用非常重要。上位效应指的是一个位点的作用取决于其他一个或多个位点的现象59。这种现象导致了这些位点对性状的奉献度背离了线性叠加模型60。通过该方式方法,能够检测出多个位点之间的互相作用及其对表型的影响。基因集合关联分析则通常选择与待研究疾病或性状相关的通路上

25、的基因作为候选基因集合,关注的不是单个基因位点而是整个代谢通路或多个候选基因整体与疾病和性状的关联性61。这种方式方法能够发现疾病和性状遗传机制中的 多基因微效 效应,是当前鉴定复杂疾病的新方式方法之一。 2.4 、关联分析的应用 关联分析经常用来鉴定复杂疾病的易感基因。2005年一项发表在Science杂志的研究鉴定了一个在老年性黄斑变性的病例-对照中有显着的频率差异的CFH基因位点62。这是第一项应用全基因组关联分析进行疾病易感基因定位的研究。在这里之后,全基因组关联分析就成为了鉴定疾病易感基因和复杂性状相关基因的主要方式方法。如今全基因组关联分析的策略是综合多个表型(表型组)数据,使用大

26、样本人群队列进行分析,如使用了344 369例样本,发现了编码的15个常见多态和9个低频突变与人类身体脂肪分布特征显着相关63。 关联分析还能够用来分析候选基因位点与位点附近的基因的表示出量的关联性,即表示出数量性状基因座(Expression Quantitative Trait Loci,简称eQTL)。eQTL是把基因的表示出量作为数量性状,研究候选位点与基因表示出的关系。例如通过关联分析发现的一个eQTL基因座为SORT164。随后通过功能实验发现SORT1与低密度脂蛋白的代谢相关,对心血管疾病治疗有重要意义64,65,66。 除了鉴定疾病易感基因,全基因组关联分析还可用于群体遗传学研

27、究。2018年的一项研究将藏族人作为 病例 ,与其有类似遗传背景的汉族人作为 对照 ,通过全基因组关联分析发现了EPAS1基因上的位点的汉藏频率差异最显着,且这些位点在藏族人中与较低的血红蛋白浓度显着相关67。 3 、连锁分析和关联分析的比拟 连锁分析和关联分析是两种有本质区别的研究方式方法,前者研究的是在一个家系中基因的遗传特性能否与疾病的传递相关,适用于家系中首位携带致病位点的个体与所收集到最年轻的个体相隔一代或几代的情况;而后者是基于样本群体的基因频率差异研究该基因能否与患病相关,能够用于分析大量无亲缘关系但拥有一个遥远的共同祖先的患病个体。基于家系的连锁分析只合适研究单基因遗传病68,

28、且鉴定的与疾病相关的区域较大,而关联分析在发现疾病的微效遗传机制时比连锁分析更为有效69,通常定位的区域非常短,因而能够应用于复杂疾病的研究。 同时关联分析也具有很多局限性。首先由于关联分析的样本在一定程度上是随机选择的,因而对照样本与病例样本的遗传背景不一致的情况会造成位点等位基因频率差异与能否患病无关,而与样本人群遗传背景相关。其次,样本的性别、年龄、职业等因素也会对结果产生影响30。因而必须控制样本人群分层来排除假阳性。可采用如下方式方法:尽量选择与患病人群相对同源的群体作为对照样本(如职业人群队列或核心家系未患病成员);分析时将多个变量作为协变量来排除其对结果的影响;对结果的p值进行校

29、正(如Genomic control校正70)(见图1)。 图1 关联分析和连锁分析原理及应用的比拟 Fig.1 Linkage analysis and association mapping 4、 小 结 当前应用于疾病易感性研究的几种方式方法,这些方式方法均基于当前基因组分型和测序技术的快速发展及人类基因组数据的极大累积。每种方式方法均有各自的优势和局限性,因而研究者能够根据待研究的疾病或性状的特性及样本属性来选择适宜的方式方法。由于疾病是多种环境和遗传因素共同作用的结果,发病机制非常复杂,因而将来仍需更多更有效的分析方式方法来研究基因组变异和疾病易感性的关系。 以下为参考文献 1PRA

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