铁硫蛋白的结构、功能与生物合成综述,病理学论文.docx

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1、铁硫蛋白的结构、功能与生物合成综述,病理学论文自上世纪 60 年代发现铁氧化复原蛋白ferredoxin 以来，人类已发现了超过 120 种含铁硫簇的蛋白质和酶，即铁硫蛋白 iron-sulfurprotein1. 铁硫簇 iron-sulfur cluster,ISC 是生物体内最古老的无机辅助因子之一，它作为蛋白质的活性基团，介入调节酶活性、线粒体呼吸、核糖体和辅助因子合成，以及基因的表示出调控2. 近 10 年来发现，多种疾病的发生均与铁硫蛋白生物合成异常有关，把铁硫蛋白的研究推向新的高潮。 而国内对铁硫蛋白的研究甚少，有文献报道亦是侧重构造和生物合成的扼要叙述。 本文就铁硫蛋白的构造、

2、功能与生物合成经过作一综述，并介绍铁硫蛋白相关疾病的发生机制。 1 铁硫蛋白的构造与功能 铁硫簇由铁离子和硫离子组成，它既可作为电子传递蛋白质的辅基介入能量转移，又可作为某些酶的活性基团介入各种生化反响。 铁硫簇中的铁离子常与蛋白质的半胱氨酸残基结合，少量与组氨酸、精氨酸、色氨酸残基结合3. 最简单的铁硫簇只含有 1 个铁原子，与 4 个半胱氨酸的硫原子结合构成四面体，即 Fe-Cys4簇。 最常见铁硫簇是菱形的2Fe-2S簇和立方体的4Fe-4S簇4,5. 2Fe-2S簇由 2 个铁离子和 2 个硫离子构成，华而不实每个铁离子还与 2 个半胱氨酸残基结合。 当前以为，4Fe-4S簇是由 2

3、个2Fe-2S簇重组而构成的，即 4 个铁离子和 4 个硫离子相间排列在正六面体的 8 个顶角处，除此之外每个铁离子还与 1 个半胱氨酸残基相连。 某些蛋白质如呼吸链复合物、结合有3Fe-4S簇，被以为是由4Fe-4S簇丢失 1 个铁离子构成的。 近年来，逐步发现构造较复杂的铁硫簇，如施氏芽孢杆菌和巴氏着色菌的 ferredoxin 中分别含有7Fe-8S、8Fe-8S簇，固氮菌的铁钼蛋白中有7Fe-9S-Mo簇6. 在生物体内 1 种蛋白质可结合多个多种铁硫簇，如呼吸链复合物含 8 个铁硫簇7,8,呼吸链复合物含有2Fe-2S、3Fe-4S、4Fe-4S簇。 各种铁硫簇镶嵌到脱辅基蛋白apo

4、-protein中构成多种铁硫蛋白，共同完成各种生物学功能。 最主要的功能是参加各种氧化复原反响，这是因其辅基中的铁离子能在 Fe2 +和 Fe3 +间相互转换9. 在人细胞中发现数十种铁硫蛋白。 如分布在线粒体的呼吸链复合物、,顺乌头酸酶、硫辛酸、生物素合成酶和铁氧化复原蛋白等，它们介入电子传递、三羧酸循环、脂肪酸氧化以及硫辛酸、生物素、铁硫簇等多种物质的合成10. 除此之外，分布在细胞质和细胞核的异丙基苹果酸异构酶、亚硫酸复原酶、谷氨酸脱氢酶、黄嘌呤脱氢酶、DNA 糖基化酶和组蛋白乙酰转移酶等，它们介入 DNA 复制、修复、tRNA 的修饰、端粒长度的维持和蛋白质翻译等经过的调节11. 可

5、见铁硫蛋白是多种生化经过的关键酶，其构造功能异常与合成障碍均可引起机体代谢异常或功能紊乱，甚至导致死亡。 2 铁硫蛋白的生物合成经过 当前，在体外能够通过化学重组的方式方法合成铁硫簇，并且可将其组装到对应的脱辅基蛋白中12.早期对铁硫蛋白生物合成的认识来源于原核生物。 原核细胞内铁硫蛋白的合成由固氮系统nitrogenfixation system、铁硫簇组装 系 统 ISC assemblysystem 和硫同化系统 sulfur assimilation system 完成13,14. 而在真核细胞中，其合成则相对复杂，分为线粒体内和线粒体外合成 2 条途径，分别由线粒体铁硫簇合成系统mi

6、tochondrial ISC assembly system和细胞质铁硫簇组装器cytosolic iron-sulfur clusterassembly,CIA 完成。 铁硫蛋白的生物合成经过在酵母和人类中有高度的保守性15. 当前，已发现 ISC系统由 17 种蛋白质，CIA 系统由 8 种酵母至 9 种人类蛋白质组成 Table 1。 本文主要以酿酒酵母为例，对真核生物铁硫蛋白的生物合成进行具体阐述。 2. 1 铁硫蛋白在线粒体内的合成 线粒体是真核细胞铁硫蛋白合成的关键部位。组成线粒体 ISC 系统的 17 种蛋白质几乎均为细胞所必须，任何成分的缺失都会导致酵母细胞的死亡。ISC 系

7、统是一个复杂的多步骤合成系统，根据反响的进程，人为地将线粒体内铁硫蛋白合成分 3 步Fig. 1。 2. 1. 1 在支架蛋白 Isu1 上合成2Fe-2S簇 在酵母线粒体内有一种保守的支架蛋白 Isu1,它在铁硫簇合成经过中作为反响平台20. 半胱氨酸脱硫酶Nfs1 能够催化半胱氨酸生成丙氨酸和硫离子，新生成的硫离子结合到 Nfs1 的半胱氨酸残基上构成过硫化物-SSH。 Nfs1 与 LYRM 家族中的 Isd11 结合，构成复合物 Nfs1-Isd11,Isd11 起稳定 Nfs1 的作用21. 含-SSH 的 Nfs1-Isd11 复合物与 Isu1 严密地结合后，将华而不实 1 个

8、S2 -转移到 Isu1 上。 合成铁硫簇还需要 Fe2 +作为原料，Fe2 +经线粒体膜转运蛋白 Mrs3/4 转运到线粒体基质。 Fe2 +再经具有铁结合功能的 Yfh1 蛋白人类 Frataxin运输至Nfs1-Isd11-Isu1 复合物。 Fe2 +从 Yfh1 转移至 Isu1,并与 S2 -互相作用生成2Fe-2S簇，此时新生成的2Fe-2S簇以松懈状态结合在 Isu1 上。 Yfh1 在铁转运经过中发挥关键作用，异常时可导致酵母细胞铁堆积。 Gerber 等22和 Schmucker 等23发现，人类Frataxin 与 NFS1-ISD11-ISU1 复合物结合失败时，会导致

9、红细胞内铁超载。 除此之外，Frataxin 对 NFS1 有变构调节的作用，当反响经过中所有成员都出现时，Frataxin 会激发 NFS1 的活性24. 在2Fe-2S簇合成时，还需要由 NADPH、铁氧化复原蛋白 Yah1 和铁氧化复原蛋白复原酶Arh1 ferredoxin reductase,Arh1 构成的电子链介入25. Yah1 本身就是2Fe-2S蛋白，在 Arh1 作用下被复原，释放的电子经 NADPH 转移到 Isu1的-SSH 上。 2. 1. 2 分子伴侣协助2Fe-2S簇转移到 Grx52Fe-2S簇在 Isu1 合成后，要进一步组装到目的蛋白质上，中途需要热休克蛋

10、白70heat shock protein,Hsp70分子伴侣系统和谷氧还蛋白 5glutaredoxin5,Grx5 协助其解离及转运。 Hsp70 分子伴侣系统包括腺苷三磷酸酶 Ssq1、DnaJ 样分子伴侣 Jac1、核酸交换因子 Mge126-28. Ssq1 与 Isu1 的功能类似，作为支架蛋白质提供反响平台16. Jac1 通过 J 构造域与Isu1 结合，募集下游分子聚集29. Mge1 在运输后期出现，将 ADP-Ssq1 转化为 ATP-Ssq1,使结合在 Ssq1的各组分解离30. Grx5 是 1 种铁硫簇转运蛋白，通常以二聚体的形式存在，能够通过半胱氨酸残基活性位点与

11、2Fe-2S簇结合。 首先，2Fe-2S簇与 Isu1 结合构成 Holo-Isu1复合物，接着 Jac1 特异地与 Holo-Isu1 结合，构成Jac1- Holo-Isu1 复合体。 该复合体能结合 ATP,启动下游反响，这导致 ATP-Ssq1 变为 ADP-Ssq1. Isu1 的保守 LPPVK 环与 Ssq1 的多肽结合位点嵌合，构成Jac1-Holo-Isu1-ADP-Ssq1 复合物。 Ssq1 与 Isu1 结合后，其构象发生改变，进一步加强与 Isu1 的结合。 而Isu1 本身构造却变得松懈，与2Fe-2S簇和 Jac1 的结合力均减弱，使得 Jac1 从复合物中分离。

12、 随后apo-Grx5 向 Ssq1 靠近，并与之结合。 Ssq1 以不同的位点同时结合 Isu1 和 Grx5,拉近了两者的距离，提高 2Fe-2S簇从 Isu1 移至 Grx5 的效率31. 反响后期，Mge1 出现并结合至 Ssq1 上，驱使 ADP 转换为ATP,最终导致结合在 Ssq1 上的组分都解离32. 此时 Grx5 携带的2Fe-2S簇经 ISC 途径或 CIA 途径，继续介入铁硫蛋白合成的后续经过。 而 Isu1 和其它分子伴侣将进入下一个周期，介入下一个铁硫簇的转移。 Ssq1、Jac1、Mge1、Grx5 都是线粒体铁硫蛋白合成的重要成员，它们基因的缺失会直接降低酶活性

13、和出现细胞内铁的堆积等33. 另外，此步反响还产生了一种功能仍不清楚的含硫复合物X-S，并已证实 X-S 经过载体运输到线粒体外后，能够调控胞质铁硫蛋白的合成。 2. 1. 3 铁硫簇目的因子协助 4Fe-4S蛋白合成第二步中释放出来的2Fe-2S簇，可直接与脱辅基蛋白质或多肽链中氨基酸残基结合构成2Fe-2S蛋白，而4Fe-4S蛋白的构成相对较复杂。4Fe-4S簇是由 Grx5 上的2Fe-2S簇变构重组而成，这中间需要 3 种蛋白质介入，包括在 Isa1、Isa2 和四氢叶酸结合蛋白 Iba57,三者称为 ISC 目的因子ISC targeting factors34. 三者是4Fe-4S

14、蛋白合成的特异因子，单个基因缺失后，铁硫蛋白仍然能够合成，这与它们在功能上存在互补作用有关。 但三者是怎样互相协调促进4Fe-4S簇合成的机制尚不明确。 现已经知道 Isa1 和 Isa2 在体内外都具有铁结合功能，人们仍在探寻求索它们的生理功能，试图不断完善该机制。 Ind1、Nfu1、Aim1 是 3 个具有特异性绑定及运输4Fe-4S簇功能的分子。 Ind1 可短暂结合4Fe-4S簇并将其输送到呼吸链复合体上，使复合体具有完好功能35. 相对来讲，Nfu1 作用更广泛，除了介入复合体的成熟外，还介入复合体和硫辛酸合酶lipoate synthase等多种蛋白质的成熟36. Aim1 与

15、Nfu1 的功能类似，两基因缺失后的表型一样，这是由于它们具有互相协调作用。 也有某些4Fe-4S蛋白的合成不需要这些特异性分子的介入，如顺乌头酸酶。经过上述 3 步反响后，线粒体内多种2Fe-2S、4Fe-4S蛋白被合成，它们以酶或功能蛋白质的形式介入各种重要的生化经过。 值得注意的是，固然将线粒体内铁硫蛋白的生物合成经过分 3 步讲述，但实际上是相互重叠，同时进行的。 2. 2 铁硫蛋白在线粒体外的合成 随着对铁硫蛋白生物合成经过的研究加深，人们发现了位于线粒体之外的铁硫蛋白合成系统-CIA 系统。 CIA 系统专门介入细胞质和细胞核铁硫蛋白的合成，而有别于 ISC 系统。 CIA 系统成

16、员缺失后，主要影响细胞质和细胞核的铁硫蛋白，而不会影响线粒体内铁硫蛋白的合成。 相反，线粒体 ISC 系统成员的异常会明显地干扰细胞质铁硫蛋白的合成。 如 ISC 系统的 Isu1、Nfs1-Isd11 和载体 Atm1人类ABCB7 的异常，将导致线粒体外硫蛋白合成减少37. 十分是 Atm1 的缺失，无法将含硫复合物运输至线粒体外，进而影响线粒体外铁硫蛋白的合成。 在酵母、斑马鱼、小鼠和人类细胞中，表现出铁硫蛋白的含量减少或活性降低的表型38. 在线粒体外合成的铁硫蛋白大多是4Fe-4S蛋白，大致能够分为两步Fig 2。 2. 2. 1 4Fe-4S簇的合成 Cfd1 和 Nbp35 都属

17、于 NTPases 家族成员，一般以 2Cfd1-2Nbp35 四聚体形式存在，在合成经过中既起支架作用，又能够绑定 2 对4Fe-4S簇。 华而不实 1 对4Fe-4S簇的合成需要线粒体提供含硫复合物作为原料，含硫复合物经线粒体膜 Atm1 载体运出，在 Cfd1-Nbp35支架上合成，然后结合至 Cfd1. 另 1 对4Fe-4S簇的合成则需要 NADPH-Tah18-Dre2 电子链的介入，Dre2 本身就是2Fe-2S蛋白，在 Tah18 的复原下，2Fe-2S簇被释放，华而不实的电子来自 NADPH. 2 个2Fe-2S簇经重组后构成4Fe-4S簇，并绑定到Nbp35 的 N-氨基末

18、端，最终 Cfd1-Nbp35 绑定了 4个4Fe-4S簇。 2. 2. 2 4Fe-4S簇至脱辅基蛋白质的转移 此阶段 需要 Nar1 蛋白 和 CIA 目的复合物 CIAtargeting complex 的共同介入40. Nar1 与 ISC 系统中 Grx5 的功能类似，可捕获 Cfd1-Nbp35 上的4Fe-4S簇，起转运作用。 Nar1 缺失后，酵母细胞质铁硫蛋白合成受阻，对氧化剂敏感，ROS 含量升高，细胞受损，寿命缩短41,42. 最近发现，在 Nar1运载4Fe-4S簇时，还有与 Grx5 同家族的 Grx3,Grx4 的协助43,44. Grx3,Grx4 能 绑 定2F

19、e-2S簇，调节细胞内铁平衡。 CIA 目的复合物包括 Cia1、Cia2 和 Mms19,华而不实 Cia1 和 Cia2 是酵母生存的必需蛋白质。 Cia1 是分子量为 WD40-repeat 蛋白家族成员之一，有 1 个 螺旋和 7 个反向片层构造，能够与 Nar1 特异地结合，是 CIA 目的复合物的活性结合位点45. Cia2 含有 1 个高度活泼踊跃的半胱氨酸残基，其能够与铁硫簇中的铁离子结合并发挥搬运作用。 Mms19 不是酵母生存的必需蛋白质，但是缺失后会使酵母寿命缩短，HeLa 细胞复制代数减少，小鼠胚胎早期死亡46,47 . 研究发现，Mms19 缺失菌株的转录因子 Rad

20、3DNA 解旋酶的表示出量降低46. 在这个传递经过中，铁硫簇的构造也发生改变，使它们能够镶嵌到多种脱辅基蛋白质的活性位点中，构成各种铁硫蛋白。 细胞质内组装成熟的铁硫蛋白，在细胞内经过分选后进入相应的亚细胞器，细胞核铁硫蛋白则在其携带的核定位信号 nuclear localization signal,NLS 的指引下主动运送到细胞核，最终发挥它们的生物学功能。 3 铁硫蛋白相关性疾病铁硫蛋白合成的异常会影响 酵母的寿命和抵御环境压力的能力。 而在人类中则会引发多种疾病，这些疾病统称为铁硫蛋白相关性疾病。 当前，已确定人类十余种疾病与 ISC 或 CIA 系统成员的基因有关Table 2，华

21、而不实较常见的是弗里德赖希共济失调friedreich ataxia,FRDA、遗传性肌病 hereditarymyopathy 和铁粒幼细胞性贫血 sideroblasticanemia48. 这些疾病固然比拟罕见，但是会严重影响患者的生活质量和寿命16. FRDA 是因神经元进行性变性坏死，导致以中枢神经系统损害为主的 1 种常染色体隐性遗传病49. 正常人 FXN 基因 编码 Frataxin 蛋白 第 1 个内含子含有 8 33 个 GAA 重复序列，而 FRDA 患者常多于 90 个，并且异常重复次数越多，病情越严重50. GAA 序列重复扩增会阻碍 FXN 基因的转录，导致患者细胞

22、内 Frataxin 表示出量减少51. 而Frataxin 正是线粒体基质内将 Fe2 +转运到支架蛋白ISCU 上的重要运载体。 Frataxin 的缺乏会导致铁硫簇合成障碍，患者体内呼吸链复合物、顺乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶等多种以铁硫簇为辅基的蛋白质的酶活性和含量均降低52. 线粒体电子传递和三羧酸循环的失调，会导致机体能量供给缺乏。 除此之外，线粒体内铁的利用减少，导致线粒体内铁不断堆积，而铁硫簇匮乏，构成负反应，使更多的铁被转运至线粒体，引发铁的恶性积累53. 铁本身也是一种氧化损伤剂，大量积累必然导致细胞损伤、凋亡甚至坏死。 当前以为，Frataxin 的缺乏会导致线粒体功能受损，进

23、而引发多条细胞信号通路发生改变，放大了Frataxin 缺失的生理学效应，这也是致使 FRDA 患者出现全身功能衰退的直接原因。遗传性肌病是以全身骨骼肌萎缩为主要特征，患者在稍微运动后易出现劳累、肌肉酸痛、呼吸短促等异常感觉和状态的终身运动耐受疾病54. 经过大量研究发现，患者多因 ISCU 基因编码支架蛋白 ISCU第 3个外显子的第 149 个碱基发生了 G A点突变，导致 ISCU 的第 50 位上的甘氨酸被谷氨酸取代55;除此之外，ISCU 的第 7 044 个碱基发生 G C突变，会导致终止密码子的提早出现，使蛋白质翻译提早终止56;这两种突变都影响细胞内正常 ISCU 的含量和功能

24、。 患者在非急性期时检查显示，呼吸链复合物、顺乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶等活性下降，肌肉病理切片出现肌细胞数减少并萎缩；急性期时可出现血氧饱和度下降，血乳酸和丙酮酸浓度升高，重者甚至出现横纹肌溶解和肌红蛋白尿57. 这类患者的ISCU 合成异常，使得铁硫簇合成时缺少促进铁离子和硫离子互相作用的平台。 进而导致铁硫簇的合成受阻，线粒体功能受损，十分是呼吸链功能不全，氧利用降低。 因而，患者较正常人对缺氧更敏感，糖酵解途径加强，相应地乳酸、丙酮酸等有害物质增加，华而不实骨骼肌需氧量最大，受损最为严重。 铁粒幼细胞性贫血是较为常见的铁硫蛋白异常相关疾病，多见家族聚集发病。 患者的 GLRX5 基因第 1

25、 个外显子最后 1 个密码子的第 3 个碱基发生了A G突变，导致错误的剪接辨别位点出现使正常的 GLRX5 表示出量下降58. 细胞内 GLRX5 表示出量的减少固然不会干扰线粒体内2Fe-2S簇的正常合成，但是 GLRX5 作为2Fe-2S簇的转运载体，会降低2Fe-2S簇与脱辅基蛋白的结合，4Fe-4S蛋白的合成和传递至细胞质的含硫复合物也减少。 正常情况下，细胞内的铁调节蛋白 1 iron regulatoryprotein 1,IRP1与 4Fe-4S簇结合，维持细胞内铁平衡；当 IRP1 没有能结合4Fe-4S簇时，IRP1 就会被过度激活并与多种血红素转录因子 mRNA 的 5

26、或3 非翻译区 untranslated regions,UTR 结合，促进aminolevulinate 、synthase 2ALAS2等血红素合成转录因子的生成58. 血红素主要存在于红细胞内，因而，大量铁被转运到红细胞内。 人 GLRX5 突变后出现小细胞铁粒幼细胞性贫血 microcyticsideroblastic anemia59;斑马鱼则可引起低色素性贫血 hypochromic anemia，甚至出现胚胎致死60. 上述铁硫蛋白缺陷患者多在儿童期或少年期发病，患者一般都会出现细胞铁超载、酶活性降低、机体代谢紊乱等病症。 随着年龄的增长，病情逐步加重，最终多死于心血管系统疾病。

27、 这些疾病几乎都是全身性疾病，不同疾病可出现一样的临床异常感觉和状态和体征。 疾病的诊断和鉴别诊断主要根据临床病史、机体功能测试以及实验室检测，华而不实最为精到准确的是进行基因序列分析，但费用相比照较昂贵61. 当前，对于这一类疾病的治疗尚未有特异性的治疗方式方法，多采用抗氧化剂、灭活自由基药物、去铁剂等进行对症治疗62.在将来基因诊断和基因治疗有望成为新的研究方向。 4 问题与瞻望 铁硫蛋白种类繁多，介入诸多的生理经过，具有重要的功能。 但是其生物合成经过中，各组分之间是怎样互相作用，互相调节还有待不断完善和补充。 在人类及多种形式生物中均发现，ISC 或 CIA 系统组分的异常可导致体内细胞代谢紊乱、生理功能降低、个体寿命缩短、甚至死亡。 这些提示，铁硫蛋白还可能介入到细胞应激、自噬、凋亡等多种生理经过。 随着人们对铁硫蛋白的构造、功能和生物合成研究的不断深切进入，将有助于揭示相关疾病发生及发展机制，为寻找新的治疗靶点提供理论基础。