黄酮类化合物及中间体的抗肿瘤筛选,药理学论文.docx

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1、黄酮类化合物及中间体的抗肿瘤筛选,药理学论文黄酮类化合物广泛分布于自然界,很多蔬菜、水果和药用植物中都含有此类成分,如黄芩、槐花、沙棘、甘草等中药中就含有多种黄酮类成分,有些是其主要活性成分.黄酮类化合物不仅分布广泛而且具有多样的生物活性,华而不实抗肿瘤的活性最为引人瞩目,抗菌活性已经得到了医学界的广泛认可. 文献中报道了很多具有较好抗菌活性的天然黄酮类化合物.然而很多黄酮类化合物溶解性能较差、生物利用度不高、生物活性不够强,这限制了其临床应用和新药开发.假如以黄酮类化合物作为先导,对其进行构造修饰,研究构造与其活性之间的关系. 通过活性优化就有可能发现活性更好、具有药用开发前景的化合物.因而

2、,设计和合成构造多样性黄酮类化合物库就显得非常必要. 我们以2-羟基苯乙酮和2,6-二羟基苯乙酮为原料,在对改良的Baker-Venkataraman重排反响进行系统研究的基础上,得到了系列黄酮类和它的中间体-丙二酮类化合物,合成道路见图1. 因而,有必要对所合成的黄酮类化合物及中间体进行抗肿瘤挑选,以期发现高效、低毒、选择性好的化合物,并分析其抗肿瘤活性和构造之间的关系,为进一步化学修饰和作用机制研究奠定基础. 1、实验部分 1.1仪器与试剂 实验的主要仪器有R206D旋转蒸发仪,XT5A型显微熔点测定仪(温度计未校订),RET控制型加热磁力搅拌器,美国HPI100质谱联用仪,美国VARIA

3、N INOVA(400MHZ)超导核磁共振仪以及APEX-2高分辨质谱仪. 人宫颈癌细胞株(Hela)引自北京师范大学生命科学院.所有试剂均为分析纯,华而不实丙酮经枯燥处理. 1.2合成(1)1-(2-羟基苯基)-3-苯基-1,3-丙二酮及其衍生物的合成在反响瓶中参加2-羟基苯乙酮162mol,无 水K2CO31.62 mmol及枯燥丙酮60mL,60油浴回流搅拌下滴加苯甲酰氯及其衍生物486mmol.滴毕,加热回流反响24h,TLC检测反响完毕.将反响液冷却至室温,过滤,用少量丙酮淋洗滤饼. 然后，参加10%乙酸(100mL)中,充分搅拌,待停止冒气泡后过滤.滤饼用水洗涤至中性,真空枯燥后用

4、丙酮重结晶得黄色针状晶体(3a3e).1-(2-羟基苯基)-3-苯基-1,3-丙二酮(3a):淡黄色针状结晶,收率80.3%,熔点:117 121 ;1H NMR(400MHz,CDCl3) :7.94(d,J=9.8Hz,2H,2 ,6 -H),7.79(dd,J=9.4,4.7Hz,1H,6-H),7.18-7.56(m,4H,3 ,4 ,5 -H,7-H),7.01(dd,J=12.7,6.3 Hz,1H,3-H),6.95(m,1H,5-H),6.85(s,1H).1-(2-羟基苯基)(4 -氟苯基)-1,3-丙二酮(3b):淡黄色针状结晶,收率71.8%,熔点:135136;1H N

5、MR(400MHz,CDCl3) 7.96(dd,J=8.7,5.4 Hz,2H,2 ,6 -H),7.78(d,J=8.0 Hz,1H,6-H),7.54-7.42(m,1H,4-H),7.18(t,J=8.5Hz,2H,3 ,4 -H),7.01(d,J=8.4 Hz,1H,3-H),6.93(t,J=7.6Hz,1H,5-H),6.79(s,1H). 1-(2-羟基苯基)-3-(4 -氯苯基)-1,3-丙 二 酮(3c):淡黄色针状结晶,收率85.7%,熔点:125 127;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 7.89(d,J=8.5Hz,2H,2 ,6 -H),7.78(d,J

6、=8.0 Hz,1H,6-H),7.48(t,J=8.1Hz,3H,3 ,4 ,4-H),7.02(d,J=8.4 Hz,1H,3-H),6.94(t,J=7.6 Hz,1H,5-H),6.82(s,1H). 1-(2-羟基苯基)-3-(4 -甲基苯基)-1,3-丙二酮(3d):淡黄色针状结晶,收率73.5%,熔点:111 114;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 7.85(d,J=8.2 Hz,2H,2 ,6 -H),7.81-7.74(m,1H,6-H),7.51-7.42(m,1H,5-H),7.29(t,J=7.3Hz,2H,3 ,4 -H),7.00(d,J=8.2Hz,1

7、H,3-H),6.92(t,J=7.6Hz,1H,4-H),6.82(s,1H),2.44(s,1H,-CH3). 1-(2-羟基苯基)-3-(4 -甲氧基苯基)-1,3-丙二酮(3e):淡黄色针状结晶,收率70.9%,熔点:107111;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 7.93(d,J=8.7Hz,2H,2 ,6 -H),7.78(t,J=6.5 Hz,1H,6-H),7.46(dd,J=15.6,8.1Hz,1H,5-H),7.03-6.88(m,4H,3 ,4 ,3,4-H),6.78(s,1H),3.89(3H,-OCH3). (2)黄酮母核及其衍生物的合成在装有回流冷凝器

8、、磁子、温度计的三颈瓶中参加1-(2-羟基苯基)-3-苯基-1,3-丙二酮及其衍生物50mmol,然后参加20mL冰醋酸和0.16mL浓硫酸,控制反响温度为95100 加热回流反响3h.TLC检测反响完毕,冷却至室温. 减压蒸馏大约15mL的冰醋酸,将剩余物倒入100mL冷水中.有白色乳状沉淀生成,静置,使沉淀析出完全,过滤,滤饼用水洗涤至中性.真空枯燥后用无水乙醇重结晶得到白色针状晶体(4a4e). 黄酮母核(4a):白色针状结晶,收率75.3%,熔点:9699 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 8.25(d,J=8.0Hz,1H,5-H),8.02-7.89(m,2H,2H,2

9、 ,6 -H),7.73(t,J=7.7Hz,1H,7-H),7.65-7.49(m,4H,3 ,4 ,5 ,8-H),7.45(t,J=7.5Hz,1H,6-H),6.90(s,1H,3-H);ESI-MS(positive):calcd forC15H10O2(M+Na+)245.24;found 245.08(M+Na)+. 4 -氟黄酮(4b):灰白色针状结晶,收率60.1%,熔点:152155 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 8.24(d,J=7.8Hz,1H,5-H),8.03-7.89(m,2H,2 ,6 -H),7.73(t,J=7.7Hz,1H,7-H),7.6

10、2-7.52(m,1H,8-H),7.45(t,J=7.5Hz,1H,6-H),7.23(d,J=8.3 Hz,2H,3 ,4 -H),6.83(s,1H,3-H);ESI-MS(positive):calcd for C15H9O2F(M+H+)241.18;found 241.00(M+H)+. 4 -氯黄酮(4c):白色针状结晶,收率57.8%,熔点:191194 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 8.24(d,J=7.9Hz,1H,5-H),7.89(d,J=8.5Hz,2H,2 ,6 -H),7.73(t,J=7.8Hz,1H,7-H),7.58(d,J=8.4Hz,1H

11、,8-H),7.52(d,J=8.5Hz,2H,3 ,4 -H),7.45(t,J=7.5 Hz,1H,6-H),6.83(s,1H,3-H);ESI-MS(positive): calcd for C15H9O2Cl(M+H+)257.63;found 257.44(M+H)+. 4 -甲基黄酮(4d):白色针状结晶,收率51.6%,熔点:115117 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 8.24(d,J=7.9Hz,1H,5-H),7.85(d,J=8.0Hz,2H,2 ,6 -H),7.72(t,J=7.7Hz,1H,7-H),7.59(d,J=8.4Hz,1H,8-H),7.

12、44(t,J=7.5Hz,1H,6-H),7.34(d,J=8.0Hz,2H,3 ,4 -H),6.87(s,1H,3-H),2.45(s,3H,CH3);ESI-MS(positive): calcd for C16H12O2(M+ H+)237.22;found237.00. 4 -甲氧基黄酮 (4e):白色针状结晶,收率61.6%,熔点:161163 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 8.24(dd,J=7.9,1.5 Hz,1H,5-H),7.98-7.86(m,2H,2 ,6 -H),7.70(ddd,J=8.6,7.2,1.7 Hz,1H,7-H),7.57(d,J=8

13、.3 Hz,1H,8-H),7.43(dd,J=11.1,4.0 Hz,1H,6-H),7.04(d,J=8.9 Hz,2H,3 ,4 -H),6.79(s,1H,3-H),3.90(s,3H,OCH3);ESI-MS(positive):calcd forC16H12O3(M+ H+)253.28;found 253.08(M+H)+. (3)5-羟基黄酮及其衍生物的合成在反响瓶中参加2,6-二羟基苯乙酮0.01mmol,无水K2CO30.08mmol及枯燥丙酮60mL,60油浴回流搅拌下滴加苯甲酰氯及其衍生物2a2d0.03mmol. 滴毕,反响24h,TLC检测反响完毕. 将反响液冷却至

14、室温,过滤,用少量丙酮洗涤滤饼. 然后转入10%乙酸(100mL)中,充分搅拌,待停止冒气泡后,过滤,滤饼用水洗涤至中性. 真空枯燥后用硅胶柱色谱分离得到5-羟基黄酮及其衍生物6a6d和3-苯甲酰基-5-羟基黄酮及其衍生物7a7d,6a和7a的展开剂为石油醚乙酸乙酯=121;6b和7b的展开剂为石油醚乙酸乙酯=81;6c和7c的展开剂为石油醚乙酸乙酯=101;7d的展开剂为石油醚乙酸乙酯=15 1.产物的表征数据如下:5-羟基黄酮(6a):淡黄色结晶,收率41.6%,熔点:160162 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 7.93(dd,J=8.0,1.6Hz,2H,2 ,6 -H)

15、,7.63-7.47(m,4H,3 ,4 ,5 ,7-H),7.02(d,J=8.4 Hz,1H,8-H),6.83(d,J=8.2Hz,1H,6-H),6.75(s,1H,3-H);ESI-MS(positive):calcd for C1 5H1 0O3(M+H+)239.24;found 239.05(M+H)+. 3-苯甲酰基-5-羟基黄酮(7a):淡黄色棒状结晶,收率45.7%,熔点:178180 ;1H NMR(400MHz,CDCl3) 12.17(s,1H,OH),7.93(d,J=7.9Hz,2H,2H,2 ,6 -H),7.59(m,4H),7.48-7.32(m,5H),

16、7.02(t,J=10.6 Hz,1H,8-H),6.86(t,J=8.2Hz,1H,6-H);ESI-MS(positive):calcd forC22H1 4O4(M+ H+)343.34;found 343.15(M+H)+. 4 -氟-5-羟基黄酮 (6b):淡黄色结晶,收率39.0%,熔点:162163 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 12.54(s,1H,OH),7.93(dd,J=8.0,5.4Hz,2H,2 ,6 -H),7.55(q,J=8.5 Hz,1H,7-H),7.23(d,J=8.3Hz,2H,3 ,4 -H),7.00(d,J=8.4Hz,1H,8-H

17、),6.83(d,J=8.2 Hz,1H,6-H),6.69(s,1H,3-H);ESI-MS(positive):calcdfor C1 5H9O3F(M+H+)257.23;found 257.04(M+H)+. 3-(4 -氟-苯甲酰基)-4 -氟-5-羟基黄酮(7b):淡黄色结晶,收率44.9%,熔点:133136 ,该化合物为初次报道;1H NMR(400MHz,CDCl3) 12.09(s,1H,OH),8.00-7.90(m,2H,2 ,6 -H),7.64(m,3H,Ar-H),7.13-7.01(m,5H,Ar-H),6.88(d,J=8.3Hz,1H,6-H). IR(KB

18、r),v/cm-1:2 926.76,1 663.62,1 693.04,1 468.73,1 415.99,1 224.22,1 159.79,814.06,729.30,604.61;HRMS(ESI,positive):calcd forC22H12O4F2(M+ H+)379.077 6;found379.076 8. 4 -氯-5-羟基黄酮(6c):淡黄色针状结晶,收率49.7%,熔点:192194 ;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 12.51(s,1H),7.87(d,J=8.6 Hz,2H,2 ,6 -H),7.62-7.47(m,3H,3 ,5 ,7-H),7.01

19、(d,J=8.4Hz,1H,8-H),6.84(d,J=8.3Hz,1H,6-H),6.72(s,1H,3-H);ESI-MS(positive):calcd forC1 5H9O3Cl(M+ H+)273.69;found 273.49(M+H)+. 3-(4 -氯-苯甲酰基)-4 -氯-5-羟基黄酮(7c):淡黄色无定形粉末,收率30.1%,该化合物熔点和1H NMR数据没有文献报道,1H NMR(400 MHz,CDCl3) 12.05(s,1H),7.86(d,J=8.2 Hz,2H,2 ,6 -H),7.64(t,J=8.4Hz,1H,7-H),7.57(d,J=8.2Hz,2H),

20、7.43(d,J=8.3 Hz,2H),7.37(d,J=8.3 Hz,2H),7.03(d,J=8.4 Hz,1H,8-H),6.89(d,J=8.4 Hz,1H,6-H);ESI-MS(positive):calcd for C22H12O4Cl2(M+ H+)412.23;found 412.05. 3-(4 -甲基-苯甲酰基)-4 -甲 基-5-羟基黄酮(7d):淡黄色针状结晶,收率76.4 %,熔点: 230234,该化合物熔点和1H NMR数据没有文献报道;1H NMR(400 MHz,CDCl3) 12.23(s,1H),7.84(d,J=8.1Hz,2H,2 ,6 -H),7.

21、65-7.52(m,3H,Ar-H),7.24(d,J=8.0Hz,2H,Ar-H),7.17(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H),7.02(d,J=8.4Hz,1H,8-H),6.85(d,J=8.3Hz,1H,6-H),2.39(s,3H,-CH3),2.34(s,3H,-CH3);ESI-MS(positive):calcd for C2 4H1 8O4(M+ H+)372.40;found372.25. 1.3体外抑制肿瘤细胞增殖活性 根据文献8方式方法,取对数生长期的Hela细胞,细胞密度为5 104个/mL,接种于96孔培养板中. 每孔RPMI-1640培养基200 L,置于37

22、 、5%的CO2及90%湿度条件下无血清孵育48h. 细胞完全贴壁后,更换新鲜培养液. 设空白对照组(普通培养基)、实验组 (10 g/mL、20 g/mL、50 g/mL、100 g/mL药物浓度梯度),每个处理组设3个平行孔,加在96孔板内. 每孔加20 L,加药完毕后放回孵箱继续培养48h后,吸弃上清液,每孔参加新鲜配制的MTT溶液(5mg/mL)20 L,在37 恒温培养箱中继续培养4h. 终止培养,弃除孔内上清液,每孔加 入DMSO 200 L,平板摇床振荡30 min(60次/min)使甲臜沉淀充分溶解. 用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔的吸光度(A值),重复测试3次,取

23、平均值为最终结果. 经培养的癌细胞通过孔中药物抑制后,按细胞抑制率=(对照组A值-实验组A值/对照组A值) 100%计算细胞抑制率. 抑制率为正值表示药物对肿瘤细胞的生长具有抑制作用,负值表示药物对肿瘤细胞的生长具有促进作用. 通过回归计算,求出半数抑制浓度,即细胞增殖抑制率为50%时的药物浓度(IC50值). 目的化合物对HeLa细胞的抗肿瘤增殖活性见表1. 从表1可 知,-丙二酮类化合物在浓度 100 g/mL时,对HeLa细胞不但没有抑制活性,相反都表现出促进增殖作用. 而关环后生成的黄酮类化合物在低浓度下(10 g/mL)对HeLa细胞没有抑制活性,但在较高浓度时表现出一定的抑制作用.

24、 这种作用成剂量依靠性关系,这也从侧面证明黄酮类化合物潜在的抗肿瘤活性. 实验结果发现,目的化合物7b对HeLa细胞表现出较强的抗增殖活性,IC50值为95.5 M,值得进一步研究. 从表1可以以看出,在黄酮母核、5-羟基黄酮的4 -位分别引入F、Cl、OCH3、CH3所构成的化合物中,4 -氟黄酮、4 -氟-5-羟基黄酮对HeLa细胞的抑制作用明显强于其他三种基团取代的化合物. 而含F化合物7b具有较强的抗肿瘤活性,这可能是由于氟原子的强吸电子作用使化合物的极性增大,进而使化合物的溶解性能加强所致. 因而在后续的黄酮类化合物构造修饰时,能够考虑在其4 -位引入氟原子来加强它们的抗肿瘤活性.

25、2、结论 近年来,我们一直致力于黄酮类化合物的构造改造和生物活性研究,该研究通过用不同的原料对改良的Baker-Venkataraman重排反响进行了系统研究. 结果发现,当2-羟基苯乙酮的6-位没有羟基时,例如2-羟基苯乙酮、2,4-二羟基苯乙酮、2,5-二羟基苯乙酮、3-甲基-2,5-二羟基苯乙酮等和苯甲酰氯及其衍生物在碳酸钾的丙酮溶液中发生Baker-Venkataraman重排反响,其酯化、重排一步完成首先得到-丙二酮类化合物,将-丙二酮关环就可得到黄酮类化合物;当2-羟基苯乙酮的6-位有羟基时,例如2,6-二羟基苯乙酮及2,4,6-三羟基苯乙酮,它们与苯甲酰氯及其衍生物在碳酸钾的丙酮溶液中可以发生Baker-Venkataraman重排反响,并且酯化、重排、关环一步完成,直接得到5-羟基黄酮、3-苯甲酰基-5-羟基黄酮及其衍生物和3-苯甲酰基-5,7-二羟基黄酮等. 从目的化合物的体外抗肿瘤活性测试结果能够看出,在黄酮母核的4 -位引入F有利于加强黄酮类化合物的抗肿瘤活性,优选出的化合物7b具有潜在的抗肿瘤增殖活性,具有深切进入研究的价值.