探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用,肿瘤学论文.docx

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1、探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用,肿瘤学论文肺腺癌是肺癌当中最常见的一种，也是死亡率很高的一种癌症，通常5年生存率只要15%1.通过对肺腺癌发生与进展中一些关键信号通路的研究，能够帮助寻找到高效的分子靶向抗癌药物。我们利用全基因组表示出谱芯片，挑选肺腺癌与癌旁组织中差异表示出的mRNA,并分析其介入的信号通路变化，讨论mRNA在信号通路中的调控作用。 1材料与方式方法 1.1标本来源 所有6例肺腺癌组织标本均来源于2018年4月到2018年5月武汉大学中南医院胸心外科手术切除标本，所有病人标本均为术前未行放疗或化疗，术后病理确诊为肺腺癌的肿瘤组织T和癌旁正常组织N的液氮冻存标本。所

2、有标本采集均经过患者家属签属知情同意，并经医院伦理委员会审核通过。所有标本均于肿瘤离体后15min内获取。 1.2一般材料 TRIzol试剂Invitrogen生命科技公司，ds-cDNA合成试剂盒Invitrogen生命科技公司，单色DNA标记试剂盒美国NimbleGen公司，含有19 000条mRNA的全基因组表示出谱芯片上海康成生物技术公司。 1.3实验方式方法 RNA制备使用TRIzol试剂相位分离并提取组织总RNA. RNA含量和质量控制：使 用 紫 外 光 吸 收 测 定 法，利 用NanoDropND-1000测定RNA浓度和纯度。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完好性。 双链c

3、DNA合成、洗脱及析出：使用Invitrogen试剂盒，根据讲明书将提取的5 g总RNA合成为ds-cDNA.参加4 g的RNA酶A溶液，轻度振荡后在37 下孵育10min,向含有RNA酶A的ds-cDNA中参加163 l苯酚氯仿异戊醇溶液，涡旋机上涡旋。将上述试剂转移到相位锁定管中，12 000 g下离心5min. 小心转移上清液至干净的1.5ml离心管中，即得到无RNA的ds-cDNA.以冷无水乙醇析出沉淀并用NanoDropND-1000定量。 样品标记：将1吸光度单位的Cy3-9荧光素加到1 g双链cDNA中，98下孵育10min.参加100pmol dNTP和100U克列诺片段并混匀

4、，37 孵育2h,参加0.1体积EDTA终止反响，异丙醇纯化已标记的ds-cDNA. 杂交和洗涤：取4 g已标记ds-cDNA参加Nim-bleGen杂交缓冲液，于42 下在杂交系统中反响16-20h.之后用冲洗缓冲液洗涤。 扫描结果：Axon GenePix 4000B扫描杂交后所得芯片，Gene-Pix pro V6.0读取原始图像。所得图像输入Nim-bleScan softwareversion 2.5进行表示出数据分析，用分位数和强多芯片平均法对基因表示出数据进行归一化。所有mRNA数据由Agilent GeneSpring GX软件进行进一步分析。对基因表示出数据进行非监督分层聚类

5、分析Unsupervised Hierarchical Cluste-ring，并对基因进行信号通路分析。 2 结果 2.1总RNA、ds-cDNA与标记DNA的质量与纯度 通 过NanoDropND1000分 析，6组 样 品 中 总RNA、ds-cDNA与标记DNA的OD260/OD280Ratio值均在1.8-2.0之间，OD260/OD230Ratio值均大于1.8表1。琼脂糖凝胶电泳示总RNA的28S、18S条带清楚明晰，且28S条带亮度在18S条带的两倍以上，5S条带模糊。该结果显示所得RNA质量和纯度可知足实验要求，用于下步实验。 2.2 mRNA非监督分层聚类分析 图1显示，根

6、据mRNA的表示出情况，6例标本被分为两大类，与肺癌组织和癌旁组织的分类相符，讲明差异表示出的mR-NA具有肿瘤组织特异性，即有大量的mRNA在肿瘤中发生了高表示出或低表示出。2.3 mRNA在肿瘤组织中的差异表示出情况=在mRNA火山图图2中，以T-test显着检验P值的负对数-log10P-Value为纵坐标，以log2倍数变化为横坐标。则图中红点表示在统计学上为差异表示出2倍以上且P 0.05的mRNA. 检测后发现，发现发生显着差异表示出大于2倍变化且P 0.05的mRNA共832条，华而不实T相对N高 表 达 的mRNA 407条。 基 因 序 号 为NM-006926的mRNA在肿

7、瘤中的表示出量为正常组织中的58.69倍P=0.026，序列号为NM-000900的mRNA在 肿瘤组织 中的表示出量为正常组 织 中 的43.69倍P=0.026，序列号为NM-138455的mR-NA在肿瘤组织中的表示出量为正常组织中的28.75倍P=0.038。表2列举了相对高表示出的407条mRNA中的20条的情况。 T相对N低表示出的mR-NA有425条。其 中 基 因 序 号 为NM-057182的mRNA在 癌旁组织 中的表示出量为肿瘤组 织 中 的17.49倍P=0.023，序号为NM-002639的mRNA在癌旁组织中的表示出量为肿瘤组织中的15.85倍P=0.049，序号为

8、NM-153246的mRNA在癌旁组织中 的 表 达 量 为 肿 瘤 组 织 中 的10.52倍 P =0.023，序号为NM-214462的mRNA在癌旁组织中的表示出量为肿瘤组织中的10.33倍P=0.0231表3列举了相对低表示出的425条mRNA中的20条的表示出情况。2.4信号通路分析=信号通路分析有助于研究者寻找在肿瘤中发生显着变化的信号通路，并进一步探寻求索华而不实被调节的基因和蛋白。分析软件将所检测到有统计学意义的差异表示出mRNA与信号通路库KEGG比照扫描，富集度分析发现有9种信号通路中的基因或蛋白发生了上调或下调表示出图3P 0.05。我们选择以为与NSCLC相关的5条信

9、号通路进行描绘叙述。 2.4.1同源重组信号通路Rad50、Rad54和DNA聚合酶 pol 表示出下降。 2.4.2人转化生长因子- 信号通路凝血酶敏感素1基因thrombospondin-1,THBS1表示出上调，smad锚着受体激活蛋白Smad anchor for receptoractivation,SARA表示出下降。 2.4.3丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路FGF、RasGFR、Rap1、FLNA、HSP72、NFAT-4和JunD等表示出上调；CACN、Cap1m、IKK、MNK1/2、MKPMAPK phosphatase,MAPK磷 酸 酶 、GLK、JNK、MKP和M

10、SK1/2表示出下降。 2.4.4细胞周期信号通路Cdc14和磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸结合蛋白等基因表示出上调；细胞周期蛋白ECycE，细胞周期蛋白依靠激酶1CDK1，起始辨别复合体origin recognition complex,ORC、微小 染 色 体 维 持 基 因 mini-chromosome mainte-nance,MCM,Chk1,2,BubR1,Cdc25B,C等表示出下降。 2.4.5 p53信号通路IGF表示出上调；周期蛋白E和Cdc2、Maspin表示出下降。 3 讨论 肺癌是人类最常见的致死性恶性肿瘤。肺癌的发生有多种蛋白质编码基因和调控基因的介入，当前对肺癌的编码

11、基因已经有了较为深切进入的了解，但对肺癌的调控网络还需要进一步研究2,3.运用高通量人类基因表示出谱芯片检测样品中的基因表示出情况，随后对其进行基因语义分析、信号通路分析等，有助于分析肺癌的调控网络，进而寻找到高效抗癌靶向药物。这也是当前常用的一种癌症研究方式方法。 在本次试验中，我们收集了6例肺腺癌肿瘤标本，采用高通量全基因组基因芯片，挑选出差异表示出大于2倍变化且P 0.05的mRNA共832条。 华而不实T相对N高表示出的mRNA 407条，T相对N低表示出的mRNA有425条。这些差异表示出的mR-NA分子可能通过被激活或抑制，改变了一些肿瘤相关信号通路的作用，进而促进了肺腺癌的发生与

12、发展。通过分层聚类分析，我们发现了差异表示出的mRNA分类与肺腺癌和癌旁组织分类相符。这也从另一个角度证明了差异表示出的mRNA与肺腺癌发生的相关性。差异基因中有的是控制癌变的驱动基因，有的是驱动基因下游基因，挑选并确认驱动基因有待进一步工作完成。 通过对这些差异表示出的mRNA与信号通路库KEGG进行比照扫描，我们发现与肺腺癌发生经过中关系比拟密切的5条信号通路，并对一些关键性的差异表示出基因在5条信号通路中的作用进行初步分析。如在人转化生长因子- 信号通路中，凝血酶敏感素1Thrombospondin-1,THBS1能够作为TGF- 通路的起始刺激物上调癌细胞的uPA和PAI1基因表示出，

13、还能与TGF- 共同作用于金属蛋白 酶 并 影 响 其 活 性。 本 研 究 发 现 在 肺 腺 癌 中THSB1的表示出上调，提示其可能通过激活了TGF- 通路而促进肺腺癌的发生；在p53介导的细胞周期停止进程中，细胞周期蛋白E的表示出是该经过正常进行的必要条件之一，CycE在细胞周期中的主要作用是促进细胞G1期的进展，同时还在细胞凋亡中起正性调 节 作 用。本 研 究 结 果 显 示 在NSCLC中，CycE的表示出下降，使p53抑制肿瘤细胞周期进展的作用失败，引起了肿瘤细胞的增殖。通过我们的分析工作，一方面为将来寻找肺腺癌的靶向治疗提供了捷径，另一方面也为其他研究癌症信号通路的工作者提供

14、了丰富的研究素材。 另外，我们之前已通过高通量基因芯片，研究了肺腺癌与癌旁组织标本中长链非编码RNAlongnon-coding RNA,lncRNA的 差 异 表 达 情 况4,5. 结合本次的实验结果，我们能够得到一些新的启示： lncRNA作为一种调控基因，能够通过对mRNA编码基因的调控作用，促进肺腺癌的发生。在本次发现的与肺腺癌发生密切相关的5个信号通路中，一些差异表示出的mRNA分子，无论是在位置和作用功能上，均与上次芯片分析所得的差异表示出lncRNA结果相偶合。结合两次芯片分析结果，我们产生了一些这样的假设：如在同源重组信号通路中，最上游的Rad50被某一lncRNA调控后表示

15、出遭到抑制，进而引起下游Rad54和DNA聚合酶 表示出的下调。 另外，可以能存在其他的一些lncRNA分子，通过抑制DNA聚合酶的 活性或 调 整 其 构 象，进 而 导 致DNA聚合酶 的下调 表示出；在p53信号通路中，Maspin的表示出下降受IncRNA的调控，之前已有研究发现了Maspin的受p53依靠和非p53依靠的表观遗传学调控6.因而我们以为，在肺腺癌的发生中，Maspin的抗血管生成和抗转移作用被抑制可能与lncRNA的表观遗传调节作用有关。 以下为参考文献 1Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancerstatisticsJ.C

16、A Cancer J Clin,2018,612:69-90. 2Booton R,Lindsay MA.Emerging role of MicroRNAsand long noncoding RNAs in respiratory diseaseJ.Chest,2020,1461:193-204. 3 周雪峰，王乐，张力，等.N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在CD133+人肺腺癌细胞中的表示出和功能研究J.武汉大学学报：医学版，2018,325:589-592. 4 周雪峰，但攀，朱明林，等.肺腺癌组织与肺癌组织长链非编码RNA表示出谱的挑选J1中华实验外科杂志，2020,29:1 489-1 4

17、90. 5Zhang Li,Zhou XF,Pan GF,et al.Enhanced expres-sion of long non-coding RNA ZXF1promoted the inva-sion and metastasis in lung adenocarcinomaJ.BiomedPharmacother,2020,684:401-407. 6Van Poppel H,Haese A,Graefen M,et al.The rela-tionship between Prostate Cancer gene 3PCA3andprostate cancer significanceJ.BJU Int,2020,1093：360-366.