青霉素生产工艺经过.docx

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1、青霉素生产工艺经过青霉素生产工艺经过Documentnumber：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998青霉素生产工艺经过一、青霉素的发酵工艺经过1、工艺流程1丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管25，孢子培养，7天斜面母瓶25，孢子培养，7天大米孢子26，种子培养56h,1:一级种子培养液27，种子培养，24h,1:二级种子培养液2726,发酵,7天,1:发酵液。2球状菌二级发酵工艺流程冷冻管25，孢子培养，68天亲米25，孢子培养，810天生产米28，孢子培养，5660h,1:种子培养液2625-24，发酵，7天，1：发酵液。2、工艺控制1影响发酵产率的因素基质浓度：在分批发酵中

2、，经常由于前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或抑制或对菌丝生长产生抑制如葡萄糖和钱的阻遏或抑制，苯乙酸的生长抑制，而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成，为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须十分注意的是葡萄糖的流加，由于即便是超出最适浓度范围较小的波动，都将引起严重的阻遏或限制，使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进行,故葡萄糖的流加不是根据糖浓度控制,而是间接根据pH值、溶氧或C02释放率予以调节。2温度：青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差异，但一般以为应

3、在25左右。温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来讲，最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵经过在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度，以利于青霉素的合成。3pH值：青霉素发酵的最适pH值一般以为在左右,有时可以以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过,由于青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中,pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率缺乏以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生

4、的碱性化合物而引起pH值上升。4溶氧：对于好氧的青霉素发酵来讲，溶氧浓度是影响发酵经过的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度下面时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高，讲明菌丝生长不良或加糖率过低，造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点,而氧消耗与碳能源消耗成正比,故溶氧浓度可以作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。5菌丝浓度：发酵经过中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,进而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上到达平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小,维持因数越大,呼吸强度越

5、高)，发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏度低的发酵液使发酵中的传氧速率上升,进而提高临界菌体浓度。6菌丝生长速度：用恒化器进行的发酵试验证实，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于时，比生产速率与比生长速率成正比,当比生长速率高于时,比生产速率与比生长速率无关。因而，要在发酵经过中到达并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来讲,维持的临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍,

6、这在实际工业生产中是很难实现的。事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多,却仍然能到达很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵经过不断有部分菌丝自溶,抵消了一部分生长,故固然表观比生长速率低,但真比生长速率却要高一些。7菌丝形态：在长期的菌株改进中，青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触,故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显着降低,使气-液两相间氧的传递速率大大提高,进而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。在丝状菌发酵中，控制菌丝形态使其

7、保持适当的分支和长度,并避免结球，是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧，并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。3、工艺控制要点1种子质量的控制丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25培养7天,真空枯燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内,26培养56h左右,菌丝浓度达6%-8%,菌丝形态正常,按10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,

8、27培养24h,菌丝体积10%-12%,形态正常,效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O.5%-1.0%玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子,然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米),亲米和生产米均为25静置培养,需经常观察生长发育情况在培养到3-4天,大米外表长出明显小集落时要振摇均匀,使菌丝在大米外表能均匀生长,待10天左右构成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过剧烈振荡才可放置恒温培养,生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在5冰箱内。工艺要求将新鲜的生产米(指收获后的孢瓶在10天以内使用)接人含有花生饼粉

9、、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28培养50-60h当pH值由6.0-6.5下降至.0,菌丝呈菊花团状,平均直径在100-130m,每毫升的球数为6万-8万只,沉降率在85%以上,即可根据发酵罐球数控制在8000-11000只/ml范围的要求,计算移种体积,然后接入发酵罐,多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳,其生产水平优于真空枯燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。2培养基成分的控制a.碳源产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液(DE值50%以上)进行流加。b.氮源氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源硫酸氨、氨

10、水或尿素。c.前体生物合成含有苄基基团的青霉素G,需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺,一次参加量不大于%,并采用屡次参加,以防止前体对青霉素的毒害。d.无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外,由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度,一般控制在30g/ml。3发酵培养的控制a.加糖控制加糖量的控制是根据残糖量及发酵经过中的pH值确定,最好是根据排气中CO2量及O2量来控制,一般在残糖降至%左右,pH值上升时开场加糖。b.补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素,使发酵液氨氮控制在O.01%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为%。-c.pH值控

11、制对pH值的要求视不同菌种而异,一般为pH能够补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。d.温度控制前期25-26,后期23,以减少后期发酵液中青霉素的降解毁坏。e.溶解氧的控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8L/(Lmin),搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f.泡沫的控制在发酵经过中产生大量泡沫,能够用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂泡敌来消泡,应当控制其用量并要少量屡次参加,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌体的呼吸代谢g.发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样,用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称镜检,根据镜检中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度,通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间,以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增加及延伸,并出现个别自溶细胞,这表示菌丝趋向衰老,青霉素分泌逐步停止,菌丝形态上即将进入自溶期,在此时期由于茵丝自溶,游离氨释放,pH值上升,导致青霉素产量下降,使色素、溶解和胶状杂质增加,并使发酵液变蒙古稠,增加下一步提纯时过滤的困难。因而,生产上根据镜检判定,在自溶期即将来临之际,迅速停止发酵,立即放罐,将发酵液迅速送往提炼工段。