《实验认知》PPT课件.ppt

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1、实验一实验一 生化实验认知生化实验认知一、实验室简介一、实验室简介二、实验室常用仪器使用二、实验室常用仪器使用三、实验室安全防护三、实验室安全防护四、生化实验考核办法四、生化实验考核办法五、清点器材五、清点器材 一、实验室简介一、实验室简介生化实验室为上海交大生农医药大平台生物化学实验室，目前承担生命科学与技术学院、医学院、药学院、农业与生物技术学院等学院本科生生物化学实验教学任务，实验教学时数达3.5万人学时数。生化本实验室拥有凝胶成像分析系统、蛋白质表达、纯化和鉴定系统、紫外分析仪、PCR仪、恒温培养箱、超声波细胞粉碎机、高速台式离心机、低温冰箱、超净工作台、超纯水机等，可同时容纳90名学

2、生参加实验。实验室现有人员4人、其中教授1人、副教授2人、实验室专职人员1人。1.务必于規定時间內到达实验室。2.务必穿实验衣。3.严禁在实验室吃东西4.离开实验室时，务必将所有物品归位，桌面保持干净。5.废液请倒入收集桶内。本实验室需要提醒学生的实验室规则：本实验室需要提醒学生的实验室规则：二、实验室常用仪器使用二、实验室常用仪器使用1、离心机2、分光光度计3、计量仪器1、离心机、离心机 在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，有过滤和离心两种方法。在下述情况下，使用离心方法较为合适。a.沉淀有粘性；b.沉淀颗粒小，容易透过滤纸；c.沉淀量多而疏散；d.沉淀量少，需要定量测定；e.母液量很少，分离

3、时应减少损失；f.沉淀和母液必须迅速分离开；g.母液粘稠；h.一般胶体溶液；使用方法使用方法1）使用前应先检查变速旋钮是否在“O”处。2）离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离 心管内，盛量占管的2/3体积，以免溢出。将 此离心管放入外套管内。3）将一对外套管（连同离心管）放在台秤上平衡，如不平衡，可用小吸管调整离心管内容物的量 或向离心管与外套间加入平衡用水。每次离心 操作，都必须严格遵守平衡要求，否则将会损 坏离心机部件，甚至造成严重事故，应十分警 惕。4）将以上两个平衡好的套管，按对称位置放到离 心机中，盖严离心机盖，并把不用的离心套管 取出。5）开动时，先开电门，然后慢慢拨动变速 旋

4、钮，使速度逐渐加快。停止时，先 将旋钮拨到“O”，不继续使用时，拔下 插头。待离心机自动停止后，才能打开 离心机盖并取出样品，绝对不能用手阻 止离心机转动。6）用完后，将套管中的橡皮垫洗净，保管 好。冲洗外套管，倒立放置使其干 燥。2、分光光度计、分光光度计 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。分光光度计的简单原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。使用方法使用方法 1）用波长设置键

5、，设置所需的分析波长。2）将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打 开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位 中。仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿 透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能 有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。3）将参比样品推（拉）入光路中，按键调 100%T，此 时 显 示 器 显 示 的“BLA”直 至 显 示“100.0”为止。4）当仪器显示器显示出“100.0”后，将被测样品推（拉）入光路，这时便可从显示器上得到被测样品的透射比或

6、 吸光度值。核酸的定量核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。光度计测量的转换光度计测量的转换:双链DNA(dsDNA)：A260=OD260=1相当于50g/ml溶液单链DNA(ssDNA)：A260=OD260=1相当于33g/ml溶液RNA：A260=OD260=1相当于40g/ml溶液测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比

7、值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。蛋白质的直接定量（蛋白质的直接定量（UVUV法）法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要

8、求蛋白的浓度较高。注意事项注意事项 为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求A280吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。这即意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。此外，混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。细菌细胞密度（细菌细胞密度（OD 600OD 600）实验室确定细菌生长密度和生长期

9、，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。3、水浴的使用4、滤纸的使用5、清洗仪器6、计量仪器 计量仪器的选择的原则：应根据量取液体的体积大小而定，同时要考虑量取的准确度。计量仪器最佳量程准确度滴管30l2mL低量筒52000mL中等容量瓶52000mL高滴定管125mL高移液管/移液枪5l10mL高微量注射器0.550ul高称量任何量度（取决于天平

10、的准确度）极高锥形瓶/烧杯255000mL极低移液管的使用 移液枪由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液枪吸头有所不同，实验室常用的移液枪根据最大吸用量有2ul,10ul,20ul,200ul,1mL等规格。移液枪的使用 使用方法使用方法 1.根据实验精度选用正确量程的移液枪。2.移液枪的吸量体积调节：移液枪调整时，切勿超过 最大或最小量程。3.吸量：将一次性枪头套在移液枪的吸杆上，有必要 时可用手辅助套紧，但要防止由此可能带来的污染；然后将吸量按至第一挡（firststop），将吸嘴垂直 插入待取液体中，深度刚浸没吸头尖端为宜，然后 慢慢释放吸量按钮以吸取液体；释放所吸液体时

11、，先将枪头垂直接触在受液容器壁上，慢慢按压吸 量按钮至第一挡，停留12秒后，按至第二档secondstop）以排出所有液体。注意事项注意事项1.吸头的更换：性能优良的移液器具有卸载吸头的机械装置，轻轻按卸载按钮，吸头就会自动脱落。2.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不 用时置移液器于架上；3.吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上 部；倾倒液体样品倾倒固体样品二、实验室安全防护二、实验室安全防护1.了解化学药品的警告标志(如图1.1所示)。2.实验操作过程中凡遇到有能产生烟雾、有毒性或腐蚀性气体时，应在通风橱中进行。2.使用毒性物质和致癌物质必须根据试剂瓶上标签

12、说明严格操作，安全称量、转移和保管。操作时应戴手套，必要时戴口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物的容器应单独清洗、处理。3废液，特别是强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。几种有代表性的危险化学药品的防护措施化学药品潜在危险防护措施十二烷基磺酸钠（SDS）刺激性、有毒戴手套氢氧化钠高腐蚀性、强刺激性戴手套苯酚剧毒、灼伤、可致癌使用通风橱、戴手套氯仿挥发性、有毒、刺激性、腐蚀性、可致癌使用通风橱、戴手套巯基乙醇挥发性、有毒、强刺激性、腐蚀性使用通风橱、戴手套 如酚触及皮肤引起灼伤，可用酒精洗涤。酸、碱等化学试剂溅入眼内，先用自来水或蒸馏水冲洗眼部，如溅入酸类物质则可再用5碳酸氢钠溶液仔细冲洗；如溅入碱类物质，可以用2硼酸溶液冲洗，然后滴入1至2滴油性护眼液起滋润保护作用。四、生化实验考核办法四、生化实验考核办法平时训练占45%作业与创新能力占45%出勤、卫生、安全占10%