《基因分型技术》PPT课件.ppt

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1、个体化分子诊断的检测技术个体化分子诊断的检测技术o个体化诊断的内容个体化诊断的内容o个体化诊断的技术简介个体化诊断的技术简介o技术原理技术原理提纲提纲年龄年龄老年人老年人儿童儿童新生儿新生儿性别性别身高身高/体重体重并发症并发症病程病程什么是个体化分子诊断什么是个体化分子诊断脏器功能脏器功能肝肝,肾肾,心心环境因素环境因素饮食饮食/吸烟吸烟/合并用药合并用药药物反应个体差异药物反应个体差异基因基因个体化基因个体化基因检测方向方向o突突变（mutation）o表达水平表达水平（levelofexpression)o甲基化修饰甲基化修饰（methylation)基因突基因突变检测技技术o测序；序；

2、o探探针；o质谱；质谱；基因突基因突变检测技技术测序测序探针探针质谱质谱原始信号原始信号光光光一级信息一级信息探针结合分子量二级信息二级信息序列是否改变分子大小是否改变推论推论推论推论最终信息最终信息碱基序列是否改变碱基序列是否改变PPiATPLightlighttimeSignalPyrosequencing-ChemistryReagentcartridgeReagentcartridge(Inkjetdelivery)(Inkjetdelivery)CCDcameradetectionCCDcameradetectionX-YdrivepositioningX-Ydrivepositio

3、ning2424wellplatewellplatemix&thermostatmix&thermostatLensarrayLensarrayQ24 Instrument Design焦磷酸测序的原理焦磷酸测序的原理AGGATCTAGGATCT?C C T TT TC CC CA A GG A AT T准确度决定临床判断的价值准确度决定临床判断的价值45%E ES SGGT TC CT TGG5T TC CGGT TA A10GGT TC CGGC C15T TGGA AT TC C20GGT TA AGGT T25C CGGA A0200400600800100012001400Seque

4、ncetoanalyze:YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATDispensationOrder:48%47%45%45%探探针技技术的常的常见应用用ARMs液相芯片基因芯片荧光PCR引物数量2222探针SybGreen引物固定于磁珠的探针固定于玻片探针荧光探针信号捕捉CCDCCD扫描仪或肉眼CCD判读光信号的有无光信号的有无探探针技技术Taqmano野生型的序列为TTGTGGTAGTTGGAGCTGGo12ASP突变型（ARMS）引物P1TTGTGGTAGTTGGAGCTGAo12ASP突变型（ARMS）引物P2TTGTGGTAGTTGGAGCTCAo12ASP突变型（ARMS）引物

5、P3TTGTGGTAGTTGGAGCAGA探针法的案例探针法的案例ARMS图图1 3条条ARMS引物的扩增曲线引物的扩增曲线（模板为（模板为3*108 copies/ul野生型质粒）野生型质粒）图图2 3条条ARMS引物的扩增曲线引物的扩增曲线（模板为（模板为3*108 copies/ul突变型突变型质粒）质粒）基因突变检测技术对比基因突变检测技术对比性能性能测序技测序技术术探针探针DHPLC荧光荧光PCR基因芯基因芯片片悬液芯片悬液芯片ARMS检测通量检测通量高高低低高高高高低低高高灵敏、准确度灵敏、准确度高高高高一般一般高高一般一般高高重复性重复性好好好好一般一般好好好好好好可否定量可否定

6、量是是否否是是是是否否否否技术可靠性技术可靠性金标准金标准/基因突基因突变检测技技术对比比o金金标准准（Goldenstandard）在在检测中的作用：中的作用：o现有技有技术所能达到的最先所能达到的最先进水平，最接近客水平，最接近客观事事实，或者，或者反映的就是客反映的就是客观事事实本身；本身；o如同病理如同病理诊断；断；为什么什么测序是金序是金标准？准？o人人类基因基因组计划划（humangenomeproject,HGP）；o1990年正式启年正式启动人人类基因基因组测序序计划划,2003年完成。年完成。n识别人人类基因基因组的所有大的所有大约3万个万个DNAn测定定组成人成人类基因基因

7、组DNA的的约30亿对核苷酸的序列核苷酸的序列测序序应用的新高度用的新高度o对定性定性检测（Qualitativetest）进行定量分析行定量分析（QuantitativeTest）；突突变定量定量检测的必要性的必要性o突突变负荷荷（mutationalload）；）；o疾病不同疾病不同阶段段（stageofdisease）；）；o对应的策略不同；的策略不同；o准确度高准确度高o灵敏度高灵敏度高o相对定量判读相对定量判读焦磷酸测序的优点焦磷酸测序的优点检测下限影响临床判断检测下限影响临床判断可检测可检测3%的突变的突变野生型突变型302060501010040908070基因所占比例基因所占比

8、例灵敏度：灵敏度：3%灵敏度：灵敏度：30%30%检测方法敏感度影响临床判断检测方法敏感度影响临床判断PCR扩增PCRamplification2h基因基因突变突变检测流程检测流程 Pyrosequencing测序样本准备Samplepreparation15minDNA提取DNApurification2hPyro测序Pyrosequencing10-100min结果分析Genotypingandidentification收取样本：血样或组织收取样本：血样或组织基因表达水平的基因表达水平的检测o检测mRNA的水平；的水平；基因表达水平的基因表达水平的检测技技术omRNA的降解；的降解；20

9、时，Y=0.62-0.004X（R=-0.981，P0.001）；15时，Y=0.965-0.001X（R=-0.709，P0.001）；Y：18sRNA含量X：离体时间o对标本位置的要求；本位置的要求；mRNA表达水平是相表达水平是相对定量定量mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-deltaCt法。基因修饰的检测基因修饰的检测DNA甲基化修饰：基因甲基化的基因甲基化的检测意意义基因甲基化检测的意义基因甲基化检测的意义 目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭非常可能有关。o甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测o肿瘤的分级o甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的指标。焦磷酸检测基因甲基化焦磷酸检测基因甲基化甲基化程度的量化甲基化程度的量化无法定量的甲基化无法定量的甲基化检测