《定点突变技术》PPT课件.ppt

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1、定点突变技术定点突变技术 基基因因突突变变包包括括单单个个碱碱基基或或片片断断的的替替换换，基因片断的插入与删除等基因片断的插入与删除等根根据据其其特特点点可可将将基基因因突突变变技技术术分分为为两两大大类：类：位点特异性突变位点特异性突变 定点突变定点突变 随机突变随机突变 定点突变的研究意义 1 对调控区进行突变对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系研究基因结构与功能之间的关系 2 对编码基因进行突变对编码基因进行突变检检验验特特定定残残基基在在蛋蛋白白质质结结构构、催催化活性和配基结合能力中的作用。化活性和配基结合能力中的作用。获得突变蛋白。获得突变蛋白。位点特异性突变的类型寡寡核

2、核苷苷酸酸介介导导的的基基因因突突变变指指用用含含有有突突变变碱碱基基的的寡寡聚聚核核苷苷酸酸片片断断作作为为引引物物，在在聚聚合合酶酶的的作作用下启动用下启动DNA分子进行复制。分子进行复制。盒盒式式突突变变是是利利用用一一段段人人工工合合成成的的含含基基因因突突变变序序列列的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，取取代代野野生生型型基基因因中中的的相相应序列。应序列。PCR介导的基因突变介导的基因突变Kunkel 法 在在E.coli中中 dUTP dUMP 在在dUTP 酶缺失体中（酶缺失体中（dut-）dUTP dUMP 在正常情况下，尿嘧啶糖基化酶在正常情况下，尿嘧啶糖基化酶(ung-)可以去

3、除掺入可以去除掺入DNA中的中的尿嘧啶残基。但在尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。的菌株中，此酶失活。因此因此 在大肠杆菌在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的菌株中生长的M13噬菌体的噬菌体的DNA中将含有中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约链遭到破坏，感染力下降约5个数量级个数量级原理原理 Kunkel 法小结用用此此种种方方法法产产生生的的突突变变体体不不必必利利用用核核苷苷酸酸探探针针标标记记来来筛筛选选阳阳性性噬噬菌菌斑斑，可可直直接接通通过过序序

4、列列分分析析来来确确定定突突变变体体，这这样样就就免免除除了了繁繁杂杂的的杂杂交程序。交程序。此此法法的的成成功功关关键键，是是要要得得到到好好的的含含单单链链模模板板DNA。（可可用用含含有有目目标标基基因因的的M13双双链链DNA 载载体体感感染染E.coli CJ236品系，其为品系，其为dut-ung-菌株菌株）Oligo诱导突变的改进方法武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导突变方法进行了改进。2-3个核苷酸替换的突变频率可达80%-85%，即使是需要有道连续4个氨基酸缺失，突变频率也高达40%。原原Kunkel Kunkel 法法改进后的方法改进后的方法DNADNA聚合酶和聚合酶和T

5、4 T4 连接酶连接酶同步加入同步加入分级退火，冰浴稳固异分级退火，冰浴稳固异源双链再加源双链再加T4 T4 连接酶连接酶直接用反应混合物转染直接用反应混合物转染经酚经酚-仿抽提后再进行仿抽提后再进行转染转染转染效率：转染效率：3 3个空斑个空斑转染效率：转染效率：7878个空斑个空斑PCR介导的基因突变介导的基因突变在在 基基 因因 5和和 3末端产生突变末端产生突变重叠延伸重叠延伸PCR大引物大引物PCR法法 重叠延伸PCR法小结缺缺点点：需需要要2对对引引物物，进进行行3次次PCR，并并且且需要对中间产物进行纯化。需要对中间产物进行纯化。优优点点：几几乎乎没没有有特特殊殊限限制制，而而且

6、且成成功功率率高高，因此运用非常广泛因此运用非常广泛 同同时时利利用用重重叠叠延延伸伸PCR机机设设可可以以对对基基因因中中心区段进行取代、心区段进行取代、插入插入、缺失缺失的突变的突变各种方法的比较寡聚核苷酸介寡聚核苷酸介导导的突的突变变 盒式突盒式突变变PCR介介导导的突的突变变优优点点保真度高保真度高简单简单易行易行突突变变效率高效率高操作操作简单简单突突变变成功率高成功率高缺缺点点操作复操作复杂杂周期周期长长合成多条引物成本合成多条引物成本高高受到受到酶酶切位点的限切位点的限制制后后续续工作复工作复杂杂TapDNA聚合聚合酶酶保真性偏低保真性偏低应用应用一步反向一步反向PCR法法Stratagen公公 司司 的的Quickchange试剂盒试剂盒一种简便快速的定点突变的方法一种简便快速的定点突变的方法Stratagen公公司司研研制制的的Quickchange试试剂剂盒盒,可可以以双双链链DNA质质粒粒为为模模板板,只只需需一一对对引引物物，进进行行一一次次PCR,在在12d内内即即可可完完成点突变过程。成点突变过程。