《定点诱变技术》PPT课件.ppt

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1、第三章 DNA突变技术基因突变包括单个碱基或片断的替换，基基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。因片断的插入与删除等。根据其特点可将基因突变技术分两大类：根据其特点可将基因突变技术分两大类：1.1.位点特异性突变位点特异性突变 定点突变定点突变 2.2.随机突变随机突变 表型筛选表型筛选 随机突变 易错PCR法(Error-prone PCR)v降低一种降低一种dNTP的量（降至的量（降至5-10）v加入加入dITP来代替被减少的来代替被减少的dNTPv缓冲液中另加缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+DNA Shufflingv外显子、单基因和基因家族的重组装外显子、单

2、基因和基因家族的重组装v随机引物延伸法随机引物延伸法v交错延伸法交错延伸法定点突变 点突变碱基碱基删除、增补和替换删除、增补和替换易错PCR(epPCR)How DNA shuffling is done in the tubev Random fragmentation of a pool of related genes;v Self-priming polymerase reaction and template switching(causing crossovers);v PCR amplification with primers of reassembled products H

3、ow DNA shuffling worksHow DNA shuffling works？Similar mutants generated byerror-prone PCR,random and site-directed mutagenesis.Single gene shufflinglibrary of point mutantsFamily gene shufflinglibrary of chimerasGenerating chimeras with crossovers of large blocks of sequences一、单基因和基因家族的重组装一、单基因和基因家族

4、的重组装X XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesHow DNA shuffling works？一、单基因和基因家族的重组装一、单基因和基因家族的重组装D N A 重组装的过程磷脂酶热稳定催化活性的分子进化磷脂酶热稳定催化活性的分子进化（Jae

5、Kwang Song等，等，2000）-葡糖苷酶耐热性的提高葡糖苷酶耐热性的提高(Mara Jesu s Arrizubieta等，等，2000）耐热耐热p-硝基苯酯酶的分子进化硝基苯酯酶的分子进化(Lori Giver等，等，1998）The fucosidase activity are shown with stick representation.Two mutations in the active site(Asp604 and Gln573)are shown in red.Two mutations in close proximity of the active site(P

6、ro511 and Asp908)are shown in magenta.Two mutations far away from the active site and on the protein surface(Val9 and Gln135)are shown in green.The rest of the substrate binding and active site residues are shown in yellow.牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）二、随机引物二、随机引物PCR(RPR)和重组装和重组装How DNA shuffli

7、ng works？多功能氧化酶的定向进化多功能氧化酶的定向进化（Hikaru Suenaga等等,2001）三、交错延伸三、交错延伸PCR突变法突变法(StEP)How DNA shuffling works？枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，等，1999）进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系的突变谱系进化后的枯草杆菌蛋白酶进化后的枯草杆菌蛋白酶E正面反面芽孢杆菌脲酸酶的定向芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化进化（Su-Hua Huang等等,2004）定点突变的研究意义 1.对调控区进行突变对调控区进

8、行突变研究基因结构与功能之间的关系研究基因结构与功能之间的关系 2.对编码基因进行突变对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用结合能力中的作用获得突变蛋白获得突变蛋白定点突变的类型定点突变的类型寡核苷酸介导的基因突变寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。分子进行复制。盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。

9、寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。PCR介导的基因突变介导的基因突变DNA定点突变的种类定点突变的种类寡聚核苷酸介导寡聚核苷酸介导替换、插入、删除替换、插入、删除盒式突变盒式突变PCR介导介导寡聚核苷酸介导寡聚核苷酸介导法 在dut+的E.coli中 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut-）dUTP dUMP dUTP酶酶 dut：dUTPase突变，可导致突变，可导致E.coli内内dUTP的量增加，当的量增加，当DNA复制时，复制时，可在很多应该加可在很多应该加dTTP的位置加入的位置加入dUTP。在正常情况下，尿嘧啶在正常情况下，尿嘧啶-糖基化酶糖基化酶(ung+)

10、可以去除可以去除掺入掺入DNA中的尿嘧啶残基。但中的尿嘧啶残基。但在在ung-的菌株中，此酶失活。的菌株中，此酶失活。在大肠杆菌在大肠杆菌dut-ung-菌株菌株中生长的中生长的M13噬菌体的单链基噬菌体的单链基因组因组DNA中将含有中将含有20-30个尿个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下链遭到破坏，感染力下降约降约5个数量级。个数量级。此法的成功关键，是要得此法的成功关键，是要得到好的含单链模板到好的含单链模板DNADNA。无无5-3外切活性外切活性3-5外切活性低外切活性低噬菌粒载体噬菌粒

11、载体（phagemid）M13K07辅助感染辅助感染产生带产生带 U 的单链的单链 DNA 这种方法得到的突变率太低，约为这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变。主要原因是含突变位点的双链位点的双链DNA，转入，转入E.coli后，被其修复系统修复了。后，被其修复系统修复了。盒盒式式定定点点突突变变PCR介导的基因突变介导的基因突变在基因在基因5和和3末端产生突变末端产生突变重叠延伸重叠延伸PCR大引物大引物PCR法法在基因5和3末端产生突变重叠延伸法定点突变技术的原理示意图重叠延伸法定点突变技术的原理示意图重叠延伸重叠延伸PCR法小结法小结缺点：缺点：需要需要2对引物，进行

12、对引物，进行3次次PCR，并且需要对中间，并且需要对中间产物进行纯化。产物进行纯化。优点：优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛。非常广泛。同时利用重叠延伸同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区段技术可以对基因中心区段进行取代、进行取代、插入插入、缺失缺失的突变。的突变。大引物大引物PCR介导的定点突变介导的定点突变各种点突变方法的比较方法方法寡聚核苷酸寡聚核苷酸介介导导的突的突变变盒式突盒式突变变PCR介介导导的突的突变变优优点点保真度高保真度高简单简单易行易行突突变变效率高效率高操作操作简单简单突突变变成功率高成功率高缺点缺点操作

13、复操作复杂杂周期周期长长合成多条引物成本高合成多条引物成本高受到受到酶酶切位点的限制切位点的限制后后续续工作复工作复杂杂TaqDNA聚合聚合酶酶保真性偏低保真性偏低应用产品一步反向一步反向PCR法法Stratagen公司的公司的QuikChange系列试剂盒系列试剂盒SBS Genetech公司的公司的Muta-direct Site Directed Mutagenesis KitStratagen公司的公司的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis KitTaKaRa公司的公司的Multipoints Mutagenesis Kit 一种简便快速

14、的定点突变的方法一种简便快速的定点突变的方法 Stratagen公司研制的公司研制的Quickchange试剂盒试剂盒,可以双链可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在，在12d内即可完成点突变过程。内即可完成点突变过程。DpnI识别序列为甲基化的识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。质粒中都会出现，而且不止一次。Overview of the QuikChange XL site-directed mutagenesis method.Steps of Muta-direct Site-Directed Mutagenesis KitOverview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method 资料表明，引入资料表明，引入3个定点突变的效个定点突变的效率为率为60%，5个定点突变的效率为个定点突变的效率为30%。Steps of Multipoints Mutagenesis Kit(TaKaRa)适用于插入片段长度在适用于插入片段长度在1.0kb以下的多点突变。以下的多点突变。