第七章基因工程重组体克隆的筛选和鉴定.pptx

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1、一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法1.原理：原理：pBR322（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin

2、）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3.选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反

3、而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程蓝色蓝色 碘没有消耗碘没有消耗 青霉素没降解青霉素没降解 阳性克隆阳性克隆抗药性标记选择应注意的问题抗药性标记选择应注意的问题抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定转化子菌落的培养时间不宜过长，以转化子菌落的培养时间不宜过长，以1216小时为小时为宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌落会降解选择药物，导致非阳性转化

4、子菌落周围选落会降解选择药物，导致非阳性转化子菌落周围选择药物浓度降低。择药物浓度降低。二、二、-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1.原理：原理：载体载体上有一段上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的）的）的 片段片段片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。的插入位点。的插入位点。受体菌受体菌受体菌受体菌基因

5、组基因组基因组基因组中有突变的中有突变的中有突变的中有突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺失）片段缺失）片段缺失）片段缺失）。可以被。可以被。可以被。可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。2.选择过程选择过程-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因

6、的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：第二节第二节 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的小鼠的二轻叶酸还原酶二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平

7、板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重组克隆重组克隆二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性

8、酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，电泳后比较结果是其它酶切这个片段，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。ABA或或B不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果插入片段插入片段三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片段。片段。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源D

9、NA插入片段引物作插入片段引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸核酸杂交杂交第四节第四节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3.识别标记识别标记32P 或或 125I。（1）放射性同位素）放射性同位素2.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片段互补的序列。插入片段互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测）探

10、针检测DNA样品。样品。1.Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载（或质粒载体），再用探针杂交。体），再用探针杂交。只有带有插入片段的重组载体才能只有带有插入片段的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片段插入片段载体含载体含插入片段插入片段插入片段探针杂交结果插入片段探针杂交结果Southern blot 筛选筛选结果结果（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法环检测

11、法DNA-RNA杂交。杂交。2）原理：）原理：3）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见双链更稳定。电镜下可见R-环形结构。环形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。1）R-环：环：R-环：是指环：是指RNA通过取代与其序列一致的通过取代与其序列一致的DNA链而与双链链而与双链DNA杂交，被取代的杂交，被取代的DNA单链与单链与RNA-DNA杂交双链所形成杂交双链所形成的环状结构。的环状结构。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！2.N

12、orthern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品。样品。主要检测插入片主要检测插入片段是否被转录。段是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产

13、物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert双位点检测法双

14、位点检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围入基因的表达产物被细菌分泌

15、到菌落周围时，就会与抗体反应形成时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1.原理原理抗原抗原抗体抗体 凝集反应。凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant(免疫吸收剂免疫吸收剂)assay1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary

16、 antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 2.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定

17、样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带

18、的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应）显色反应在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色3.ELISA的局限性的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用最好用单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody）:由单一由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。一特定抗原表位的抗体。临床检验常用的单抗

19、临床检验常用的单抗四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blotting）法）法1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质蛋白质维持线性状态维持线性状态，并与蛋白质，并与蛋白质结合，使蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷带上负电荷。SDS:（SDS-PAGE）：）：聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electropho

20、resis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动，移动的速率主移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（链的长短）小（链的长短），从，从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer点样点样电泳方向电泳方向蛋白质电泳的分子蛋白质电泳的分子量标准量标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位,等于等于

21、一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。一克约为一克约为6106102323道尔顿道尔顿Dalton凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝：灵敏度低、只能检出灵敏度低、只能检出0.3-1g/带带，但可，但可褪色回收。褪色回收。硝酸银：硝酸银：灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色直接染色电泳结果直接染色电泳结果（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、

22、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白Western装置装置 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。

23、）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程过程结果结果单抗单抗blotting结果结果一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统第六节第六节 转译筛选法转译筛选法 能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提翻译成蛋白质的细胞提取物。取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选借助无细胞翻译系统，通

24、过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。其产物是否符合预期。适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。二、转译筛选二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物与预期的产物分子量相符？分子量相符？三、杂交抑制转译法三、杂交抑制转译法mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链双链后就不能被核糖体翻译

25、出蛋白质（转译被后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。抑制）。单链单链mRNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译1.原理原理2.过程过程四、杂交释放转译法四、杂交释放转译法1.原理：原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的放出与它对应的mRNA，进行体外转录。，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）

26、。因产物（如分子量、免疫源性等）。2.过程过程硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编 码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋特异结合的蛋白质因子。白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维

27、素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记五、五、DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略第七节第七节 几种常用的几种常用的真核生物重组基因选择方法真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。提供甲基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）一、哺乳

28、动物基因转移的选择标记一、哺乳动物基因转移的选择标记1.胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase,tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFR氨甲喋啉（氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 胸苷酸激酶胸苷酸激酶的补救作用的补救作用TK+细胞细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用能产生胸

29、苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（培养基中的胸苷（T）合成）合成dTTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌呤次黄嘌呤的补救作用的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP dTTP dCTP 次黄嘌呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 HAT培养基：培养基：Tk-细胞株。细胞株。TK基因。基因。宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记（2）TK选择过程选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因

30、的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。真核细胞核苷酸的合成需要真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸四氢叶酸提提供甲基。供甲基。2.二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1）选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸DHFR+细胞细胞二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能合成四氢叶酸。能在能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存的培

31、养基中生存不需要补救！不需要补救！DHFR-细胞细胞DHFR-细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。以不能合成四氢叶酸。需要补救！需要补救！不能在无不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。的培养基中生存。胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻时，时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:DHFR-细胞株（不能在细胞株（不能在无核苷酸无核苷酸的培的培养基中生长）。养基中生长）。宿主

32、细胞宿主细胞（2）选择过程）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。免补救。无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！补救！氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压”添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制内源性内源性DHFR的的补救作用，可提高选择。补救作用，可提高选择。DHFR+基因。基因。载体标记载体标记只有转入只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌

33、的蛋白质合成不能正常进行，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但但不影响真核生物不影响真核生物。3.新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor）（1）选择原理）选择原理 新霉素（新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，氨基糖苷，对对真核细胞和原核细胞都有毒性真核细胞和原核细胞都有毒性。G418（geneticin）新霉素抗性基因新霉素抗性基因-neor细菌的新霉素抗性基因（细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种）编码一种磷酸转移酶（磷酸转移酶（APH），能使，能使G418失活。失活。G418真核细胞真核细胞死亡死亡G418存活存活neor真核细胞真核细胞含

34、含致死剂量致死剂量G418的完全培养基。的完全培养基。G418培养基培养基真核细胞株均可。真核细胞株均可。neor基因。基因。宿主细胞宿主细胞载体标记载体标记（2）选择过程）选择过程G418：（：（100-800 g/mL）CAT是由大肠杆菌转座子是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化编码的，催化氯氯霉素发生乙酰化霉素发生乙酰化失活。失活。氯霉素氯霉素cat含氯霉素的完全培养基。含氯霉素的完全培养基。真核细胞株均可。真核细胞株均可。cat基因。基因。乙酰氯霉素乙酰氯霉素4.氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶（CAT）（1）选择原理）选择原理（2）选择条件选择条件（3）宿主细胞宿主细胞（4）载体标

35、记）载体标记chloramphenicol acetyl transferase在转化的细胞提取物中测定是否有在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。乙酰氯霉素。（5）CAT分析方法分析方法 免疫学检查：免疫学检查：用抗用抗CAT的血清进行的血清进行Western blot或或ELISA，检查，检查CAT的表达。的表达。Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen.Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular B

36、iochemicals and Molecular Probes.分析乙酰氯霉素分析乙酰氯霉素二、植物转化体报道基因筛选法二、植物转化体报道基因筛选法（1 1）大大肠肠杆菌的杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）；）；（2 2）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；）；（3 3）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。1.报道基因（报道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它2.几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原

37、理4-甲甲-D-葡糖醛酸葡糖醛酸荧光产物荧光产物-D-葡萄糖醛葡萄糖醛酸糖苷酶酸糖苷酶 GUS水母绿色荧水母绿色荧光蛋白光蛋白GFP紫外光照紫外光照发绿色荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡糖醛酸葡糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物-D-葡萄糖醛酸糖葡萄糖醛酸糖苷酶苷酶 GUSFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATPFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP转入萤火虫转入萤火虫的的luciferase的烟草的烟草植物细胞中适用的报道基因植物细胞中适用的

38、报道基因酶活性酶活性方法是否成熟方法是否成熟新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶成熟成熟潮霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶成熟成熟二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶成熟成熟氯霉素乙酰基转移酶氯霉素乙酰基转移酶成熟成熟庆大霉素乙酰基转移酶庆大霉素乙酰基转移酶成熟成熟胭脂碱合成酶胭脂碱合成酶成熟成熟章鱼碱合成酶章鱼碱合成酶成熟成熟-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶成熟成熟链霉素磷酸转移酶链霉素磷酸转移酶成熟成熟萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶成熟成熟细菌荧光素酶细菌荧光素酶成熟成熟苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶成熟成熟磷酸肌醇乙酰转移酶磷酸肌醇乙酰转移酶成熟成熟乙酰乳酸合酶乙酰乳酸合酶不成熟不成熟绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白成熟成熟