mirneasyminikit中文版.pdf

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1、miRNeasy Mini kit实验前注意事项：1、这个实验方法是为了从组织（和/或）细胞中提取总 RNA，包括小分子 RNA。2、有必要的话，可以加热使 Buffer RWT 中的沉淀溶解。3、除了步骤 5 中的液相分离，其他操作均应该在室温下进行（15-25），动作要迅速。4、Buffer RWT and Buffer RPE 原液在使用前应加入（96-100%）的乙醇（根据标签上的体积添加）。5、在开始第一步之前，根据 miRNeasy Mini Kit Handbook 中的建议选择合适的打碎组织细胞的方法。实验步骤：1、向组织或细胞中添加 700L 的 QIAzol 裂解液，（组织

2、的话，可以称取大概50mg，加入 1ml 裂解液，最后吸取 700L）选择合适的方法裂解细胞或组织。（组织一般选用匀浆机，每一个组织大概研磨 3-4 次）。2、室温（15-25）下孵育匀浆 5 分钟。3、每管中加入 140L 的氯仿（三氯甲烷），并盖紧盖，大力晃动 15s。4、室温下孵育 2-3 分钟。5、4离心 15 分钟（12000g）。6、将上层清液转移到一个新的 EP 管中，注意避免不要混入下层液相，加入倍体积（通常是 525L）的无水乙醇，然后混匀。7、吸取 700L 的样本转移到 RNeasy Mini 柱内，并放入 2ml 的收集管中。室温离心 8000g，15 秒。弃掉收集管中

3、的液体。8、重复步骤 7，收集将剩余的样本。9、选做：根据手册附录 B 中的说明进行 DNA 酶消化（不需要使用 miScript PCRsystem 进行 miRNA 的鉴定）。10、11、12、13、14、15、向离心柱内加入 700L 的 Buffer RWT，8000g 离心，15s，弃滤液。吸取 500L 的 Buffer RPE 于离心柱内，8000g 离心，15s，弃滤液。吸取 500L 的 Buffer RPE 于离心柱内，8000g 离心，2min，弃滤液。选做：将 RNeasy Mini 柱移入一个新的 2ml 收集管内，最大转速离心将 Neasy Mini 柱转移到新的的 EP 管内。于柱内加入 30-50L 的 DEPC 水。如果期望 RNA 产量大于 30g，可以加入额外的 30-50LDEPC 水，或者使如果用的样本是细胞，这一步是选做的。1min。8000g 离心 1min。用第 14 步中收集到的液体（如果需要一个较高的 RNA 浓度），再次进行离心，收集滤液。