实验考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.pdf

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1、实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。二、实验原理二、实验原理考马斯亮蓝 G250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为 595nm。考马斯亮蓝 G-250蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm 下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰

2、因素少的特点。离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。3.先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热 20min 后，再选择须用的单色光波长。2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入 45 高度，置第一格）置于光路上，调节100透射比按钮，使吸光度值A=0.00。3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。

3、5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。三、试剂与器材：试剂与器材：1.试剂：（1）0.9NaCl：9gNaCl 溶解在 1L 的容量瓶中。（2）标准蛋白质：称取 50mg 结晶牛血清蛋白定溶于 50ml 容量瓶里。（3）染液：考马斯亮蓝 G-2500.5g，溶于 250mL95%乙醇，再加入 500mL85(WV)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取 150mL 然后加蒸馏水定容到 1000mL，保存于棕色瓶中，备用。2.器材：试管；吸管 10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722 分光光度计四、操作方法操作方法1.标准曲线的制备取 6 支试管，按下表加入各：以各管相质含量（mg）A595

4、为纵标准曲线。应标准蛋白管号为横坐标、012345坐标，绘制2.待测样中加蛋白1.0mL，再考马斯亮剂，摇匀，后，在下吸光度A595。根据从标准曲白质含量。样品的浓五、实五、实及分析及分析六、思六、思蛋白质含有哪些方点是什标准蛋品测定白溶液00.20.40.60.81.0质样品(ml)加入 5.0mL蓝 G-250 试0.9%NaC放置 5minl 溶液1.00.80.60.40.20595nm 波长(ml)值，记录所测 A595待测样线上查得蛋品(ml)并计算蛋白考马斯度（mg/ml）。亮蓝试5.05.05.05.05.05.0验结果验结果剂(ml)摇匀，放置 5min，测吸光度值考题考题量的测定还A595nm法？其优缺么？