《核酸检测技术》PPT课件.ppt

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1、第2章核酸检测技术核酸检测技术直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。核酸的分离纯化PCR技术核酸杂交技术第1节核酸的分离纯化核酸的分离纯化的原则1.保持核酸一级结构的完整性2.提高核酸制品的纯度技术路线的设计技术路线的设计破碎细胞的方法破碎细胞的方法机械机械（匀浆、超声破、研磨等）（匀浆、超声破、研磨等）非机械非机械（化学处理、生化法）（化学处理、生化法）沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。优点优点缺点缺点乙醇乙醇对盐类沉淀少，对盐类沉淀少，易挥发除去，不易挥发除去，不影响后续实验影响后续实验需要量大，低温操需要量大，低温操作作异丙醇异丙醇需体积小，速度需

2、体积小，速度快，一般不需低快，一般不需低温长时间放置温长时间放置易使盐类、糖类与易使盐类、糖类与DNA共沉淀；异丙共沉淀；异丙醇难以挥发除去醇难以挥发除去核酸浓度检测与完整性测定方法核酸浓度检测与完整性测定方法浓浓度度测测定定 紫外分光光度法紫外分光光度法 260nm 荧荧光光度法光光度法 EB荧光完整性测定完整性测定琼脂糖凝胶电泳法：以琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。酸凝胶电泳结果为依据。基因组基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；完整的或降解很少的总完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧电泳图谱中，三条带的

3、荧光强度积分应呈特定的比值光强度积分应呈特定的比值问题一：问题一：DNA样品不纯样品不纯 抑制后续酶解和抑制后续酶解和PCR反应反应DNA提取常见问题提取常见问题DNA提取常见问题提取常见问题问题问题二二：DNA降解降解DNA提取常见问题提取常见问题问题问题三三：DNA提取量少提取量少真菌真菌昆虫昆虫第2节PCR扩增技术PCR,a DNA photocopierPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程

4、技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明Kary B.Mullis（1944）1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余项重大为十余项重大科学发明之首科学发明之首,

5、比喻比喻1989年年为为PCR爆炸年爆炸年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。1.PCR的基础PolymeraseChainReactionPCRThe only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.PolymeraseChainReactionThe products of the first reaction become substrates of the following one,and so on.PCRPolymeraseChainReactionPCRComponents：Thermosta

6、ble DNA Polymerase，Target DNA，Pair of Primers，dNTPs，Mg+ions，Buffer solution Denaturation：The target DNA(template)is separated into two stands by heating to 95Primer annealing:The temperature is reduced to around 55 to allow the primers to anneal.Polymerization(elongation,extension):The temperature i

7、s increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+.The PCR cycle:Three different steps in each PCR cyclePCR的扩增？的扩增？How does PCR workThe first cycleThe second cycle How does PCR workThe third cycleThe fourth cycle2.PCR的类型1.多重PCR（multiplex PCR）2.巢式PCR（nested PCR）3.

8、定量PCR（quantitative PCR）4.不对称PCR（asymmetric PCR）5.反向PCR（inverse PCR）6.逆转录PCR（reverse transcription PCR）7.Overlap PCR PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLYTypically generates a product band for each primer pair多重PCR（multiplex PCR）:What2.1 多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR:WhyDetect several gen

9、es at onceeg.transgenic plant screenInternal controlsVERY importantTells you how well the PCR reaction workedReduces“false negatives”Reduces“false positives”多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR:HowSame as regular PCRCare in primer designMuch greater chance of primer-dimersMuch greater chance of artifac

10、tsAnnealing temperatures must be close多重PCR（multiplex PCR）A Typical Multiplex PCR ReactionSterile Water 34.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2(50mM)2.5 uldNTPs(10mM each)1.0 ul Primer1FWD 1.0 ul Primer1REV 1.0 ul Primer2FWD 1.0 ul Primer2REV 1.0 ul Primer3FWD 1.0 ul Primer3REV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ul

11、DNA Template 1.0 ulTotal Volume 50.0 ul多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR:ExampleThree primer pairsControl,resistance,and trait genesControl gene fragment is largest and(almost)faintestTrait gene is smallest and brightestResistance GeneTrait GeneControl GenePrimers多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR:Ex

12、ampleThree primer pairsResistance GeneTrait GeneWhich are transgenic?Control GenePrimers多重PCR（multiplex PCR）Nested Multiplex PCR2nd Stage PCRDilute 100 foldBetween 1st&2nd stage reactions1F1R2R3R5R6R3F2F6F4F5F4RPrimary Multiplex RT-PCR 多重PCR（multiplex PCR）2.2 定量PCR（quantitative PCR）实时荧光定量实时荧光定量PCR（R

13、eal time Quantitative PCR）：）：在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始进程，对起始模板进行定量分析的方法。模板进行定量分析的方法。Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle(in real time)as opposed to the endpoint dete

14、ction荧光定量荧光定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（1）定量原理）定量原理三个概念：三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过CtCt值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标

15、：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、：基线期、指数增长期指数增长期和和平台期平台期。Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）基线期基线期平台期平台期平台期平台期荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理荧光域值荧光域值Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）基线期基线期指数扩指数扩增期增期平台期平台期荧光域值荧光域值手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段荧光定量荧光定量PCR

16、PCR原理原理CtCt值值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value 纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性Ct值的重现性值的重现性定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率扩增效率扩增效率 E（amplification efficiency）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个

17、循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。在在扩扩增增产产物达到物达到阈值线时阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧荧光光扩扩增信号达到增信号达到阈值阈值强强度度时扩时扩增增产产物的量物的量.在在阈值线设阈值线设定以后定以后,它是一个常数它是一个常数,我我们设为们设为M方程式方程式(1)两两边边同同时时取取对对数得数得:log M=log X0(1+

18、Ex)Ct (2)整理方程式整理方程式(2)得得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)CT=-k lg X0+b（线线性方程）性方程）LogX0浓浓度与循度与循环环数呈数呈线线性关系，根据性关系，根据样样品品扩扩增达到增达到域域值值的循的循环环数即数即Ct值值就可就可计计算出算出样样品中所含的模板量。品中所含的模板量。标准标准曲曲线线：CT值对值对DNA0作图作图0 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentratio

19、n（2）荧光定量）荧光定量PCR的化学原理的化学原理1.Hydrolysis probes（水解探（水解探针）(TaqMan,Beacons)2.DNA-binding(intercalating)agents（结合）合）(SYBR Green,Eva Green,LC Green)3.Hybridization or FRET probes（杂交）交）(Light Cycler)非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、AmplisensorQQRDNA产物的荧光标记产物的荧光标记

20、SYBR Green 法法 q SYBR Green 能能结结合到双合到双链链DNA的小沟部位的小沟部位q SYBR Green 只有和双只有和双链链DNA结结合后才合后才发荧发荧光光q 变变性性时时，DNA双双链链分开，无分开，无荧荧光光q 复性和延伸复性和延伸时时，形成双，形成双链链DNA，SYBR Green 发荧发荧光，在此光，在此阶阶段采集段采集荧荧光信号。光信号。信号信号强强度与度与DNA分子分子总总数目成正比数目成正比。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionE

21、xcitationExcitationSYBR Green 法法优优缺点缺点 q 对对DNA模板没有模板没有选择选择性性 -适用于任何适用于任何DNAq 使用方便使用方便 -不必不必设计设计复复杂杂探探针针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优优 点点q 容易与非特异性双容易与非特异性双链链DNA结结合，合，产产生假阳性生假阳性 但可以通但可以通过过融解曲融解曲线线的分的分析析，优优化反化反应应条件条件q 对对引物特异性要求引物特异性要求较较高高缺缺 点点Tm值值：DNA解解链链一一半半时时的温度的温度将温度与将温度与荧荧光光强强度的度的变变化求化求导导。(-dI/dT)与目标序列互补TaqMan

22、法法TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针v 5端端标记标记有有报报告基告基团团(Reporter,R)，如，如FAM、VIC等等 v 3端端标记标记有有荧荧光淬光淬灭灭基基团团(Quencher,Q)v 探探针针完整，完整，R所所发发射的射的荧荧光能量被光能量被Q基基团团吸收吸收，无，无荧荧光，光，R与与Q分开，分开，发荧发荧光光v Taq酶酶有有 53外切核酸外切核酸酶酶活性，可水解探活性，可水解探针针每扩增一条每扩增一条DNADNA分子，释放一分子，释放一个荧光信号，可以在循环过个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光程中任一点检测荧光TaqMan法法优优缺点缺点q 对对目目标标序

23、列的高特异性序列的高特异性 -阴性阴性结结果确定果确定q 设计设计相相对简单对简单 -与目与目标标序列某一区序列某一区域互域互补补q重复性比重复性比较较好好优优 点点q 只适合一个特定的目只适合一个特定的目标标q 委托公司委托公司标记标记，价格，价格较较高高q 不易找到本底低的探不易找到本底低的探针针缺缺 点点Title=(Real-time PCR)Timespan=2009-2012.Published Items in Each YearExamples of SYBR Green real-time PCR assays for detection of plant pathogeni

24、c fungi(last 6 years)（3）定量方法）定量方法q 绝绝对对定定量量（Absolute Quantification）确确定定未未知知样样本中某个核酸序列的本中某个核酸序列的绝对绝对量量值值，即通常所，即通常所说说的拷的拷贝贝数。数。q 相相对对定定量量（Relative Quantification）测测定定一一个个测测试试样样本本中中目目标标核核酸酸序序列列与与校校正正样样本本中中同同一一序序列列表表达达的的相相对对变变化。化。v 2-C（t）v 双双标标准曲准曲线线法法相相对对定量中的内定量中的内标标 内内标标通常是通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家

25、基因 在在细细胞中的表达量或在基因胞中的表达量或在基因组组中的拷中的拷贝贝数恒定，受数恒定，受环环境因素影响小境因素影响小内内标标定量定量结结果代表了果代表了样样本中所含本中所含细细胞或基因胞或基因组组数量数量绝对绝对定量的定量的标标准准样样品：品：已知拷已知拷贝贝数的数的质质粒粒DNA和体外和体外转转入的入的RNA 相对定量：参照因子相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法相对定量分析方法1 -Ct相对定量分析方法相对定量分析方法2：双标准曲线法双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同目标基因与内参基因扩增效率不同特异性特异性 重复性重复性 灵敏度灵敏度其他问题其他问题常见

26、问题讨论常见问题讨论扩增的特异性扩增的特异性引物？引物？Tm，重新设计引物，优化条件，重新设计引物，优化条件Tm重复性重复性-判断实验优劣的重要指标判断实验优劣的重要指标判断指标判断指标：主要为标准差（：主要为标准差（SD）和变异系数（）和变异系数（CV）影响重复性的因素影响重复性的因素：lPCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率扩增效率。l目的基因的初始浓度：目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数量级的样本使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。或作平行孔。l标准曲线的影响：不少于标准曲线的影响：不少于5个稀释度

27、的标准品，涵盖待测样本个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的或是体外合成、转录的RNA。影响灵敏度的因素影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响反应体系中形成的引物二聚体的影响 l可可以以用用水水解解探探针针代代替替SYBR Green I，有有文文献献报报导导使使用用水水解解探探针针的的敏感性要比敏感性要比SYBR Green I高出高出10倍。倍。l可以使用热启动办法或使用特殊处理的可以使用热启动办法或使用特殊处理的

28、Taq酶酶l要尽可能地优化引物设计要尽可能地优化引物设计l如如果果反反应应体体系系中中出出现现PCR的的抑抑制制因因素素，应应适适当当将将目目的的基基因因的的浓浓度度稀释后再进行扩增。稀释后再进行扩增。l注注意意避避免免室室温温混混合合各各种种试试剂剂，并并且且在在一一经经混混合合后后立立即即开开始始进进行行扩扩增。增。循环数循环数 MgMg2 2的浓度的浓度 Q1:Q1:无无CtCt值（信号）出现值（信号）出现可能性可能性不大不大l检测荧光信号的步骤有误检测荧光信号的步骤有误:一般一般SG法采用法采用72延伸时采集，延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。法则一般在退

29、火结束时或延伸结束采集信号。l引物或探针降解引物或探针降解:可通过可通过PAGE电泳检测其完整性。电泳检测其完整性。l模板量不足模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。做起。l模板降解模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。Q2:CtQ2:Ct值出现过晚（值出现过晚（CtCt3838）l扩增效率低扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。用三步法进行反应；适当降低退火温度；

30、增加镁离子浓度等。lPCR各种反应成分的降解或加样量的不足。各种反应成分的降解或加样量的不足。lPCR产物太长产物太长:一般采用一般采用80-150bp的产物长度。的产物长度。Q3:Q3:标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳l加样存在误差加样存在误差:使得标准品不呈梯度。使得标准品不呈梯度。l标准品出现降解标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。准品。l引物或探针不佳引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针重新设计更好的引物和探针l模板中存在抑制物，或模板浓度过高。模板中存在抑制物，或模板浓度过高。Q4:Q4:阴性对照也出现

31、明显的起飞阴性对照也出现明显的起飞l反应反应mix或水被污染。或水被污染。l引物二聚体的出现：引物二聚体的出现：用用SG法在法在35cycles以后阴性出现起飞属正以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。常情况，可配合熔解曲线进行分析。l反应过程中探针的降解：用反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。电泳对探针进行检测。lROX校正的问题：如果使用了，则可能是校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。的降解所造成。Q5:Q5:熔解曲线不止一个主峰熔解曲线不止一个主峰l引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结

32、构的出现。l引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。浓度配比。l镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mixmix试剂盒。试剂盒。l模板有基因组的污染：模板有基因组的污染：RNARNA提取过程中避免基因组提取过程中避免基因组DNADNA的引入，的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。或通过引物设计避免非特异扩增。Q6:Q6:扩增效率低扩增效率低l反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。l反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改

33、为三步扩增法。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。l反应体系中有反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。响。两步扩增反应两步扩增反应 Real-time qPCR:循环数循环数Step温度温度时间时间检测检测说明说明11952minOff起始模板预变性起始模板预变性35-4519515secOff模板变性模板变性260-6820-60secOn退火退火/延伸延伸三步扩增反应三步扩增反应 Real-time qPCR:循环

34、数循环数Step温度温度时间时间检测检测说明说明11952minOff起始模板预变性起始模板预变性35-4519510-20secOff模板变性模板变性255-6510-20secOff退火退火37220-60secOn延伸延伸3.提高提高PCR反反应应特异性的策略特异性的策略巢式巢式PCR（Nest-PCR）四种策略 递减递减PCR（TouchDown PCR）热启动热启动PCR（HotStart PCR）使用使用PCR增强剂增强剂策略之一巢式巢式PCR（Nested-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为

35、同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。巢巢式式PCR可可以以增增加加有有限限量量靶靶序序列列（如如稀稀有有mRNA）的的灵灵敏敏度度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。First roundprimersFirst roundPCRSecond roundprimersSecond roundPCRGene of interestNested PCR:to increase specificity策略之二递减递减PCR（TouchDown PCR）递递减减PCR通通过过在在PCR的的前前几几个个循循环环使使用用严严谨谨的的退退火火条条

36、件件提提高高特特异异性性。循循环环设设在在比比估估算算的的Tm高高大大约约5的的退退火火温温度度下下开开始始，然然后后每每个个循循环环降降低低1-2,直直到到退退火火温温度度低低于于Tm 5。特特异异性性最最高高的的目目的的模模板板会会被被优优先先扩扩增增，这这些些产产物物在在随随后的循环中继续扩增占据优势。后的循环中继续扩增占据优势。递递减减PCR对对于于那那些些不不了了解解引引物物和和目目的的模模板板同同源源性性程程度度的方法更为有用，如的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。策略之三热启动热启动PCR（HotStart PCR）热热启启动动主主要要是是通通过过抑抑制制一

37、一种种基基本本成成分分延延迟迟DNA合合成，直到成，直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度；现现在在有有很很多多公公司司都都有有HotStart Taq酶酶出出售售，该该酶酶具具有有热热启启动动的的性性能能，使使用用简简单单方方便便，适适合合于于高高通通量量应应用用；热热启启动动PCR是是除除了了好好的的引引物物设设计计之之外外，提提高高PCR特特异性最重要的方法之一。异性最重要的方法之一。策略之四使用使用PCR增强剂增强剂 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。的增强剂。其其可可能能的的机机理理是是降降低低熔熔解解温温度度，从从而而有有助

38、助于于引引物物退退火火并并辅辅助助DNA聚合酶延伸通过二级结构区聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 4.PCR 常见问题及分析Denaturation TempAnnealing TempExtension TempTimeNumber of CyclesReaction Volume“Odd”ProtocolsPCR Cycling ParametersWaterBufferDNA templatePrimersNucleotidesMg+ions DNA PolymeraseExtrasReaction ComponentsIMPORTANT!Basic Exper

39、imental DesignA well-designed experiment can keep you from ever getting into trouble!A poorly-designed experiment is asking for problems!Main point:Always use CONTROLSPositive controlSo youll know what a successful result looks like.Negative controlLets you know if you have contamination.Experimenta

40、l Design:ControlsNo positive or negative controlsWhat does this result mean?Only a positive controlHow do we know the result isnt due to contamination?Both positive and negative controlsResults can be interpreted withconfidence.UU+U-+PCR常见问题之一无扩增产物（假阴性）1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不

41、合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题

42、之二 非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当

43、减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增PCR常见问题之三 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 2PCR常见问题之三1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度

44、适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除除酶酶及及不不能能耐耐高高温温的的物物质质外外，所所有有试试剂剂或或器器材材均均应应高高压压消消毒毒。所所用用离

45、离心心管管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR常见问题之五-引物二聚体5.分子检测的靶标基因Purvis and Hector,2000,Nature昆虫昆虫菌物菌物昆虫和菌物的物种丰富度昆虫和菌物的物种丰富度The mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I(COI)gene is one of the most popular markers for population genetic and phylogeographic stud

46、ies across the animal kingdom.53LCOF 1490*Ag1718F14012942COItRNA Coding RegionsGene Coding RegionsControl RegionBarcoding RegionForward PrimerReverse PrimerHCOR 2198*Ag1859RmtDNA GenomeThe order of genes on the mitochondrial genomeuRelatively well studied at the biochemical level uSize and structure

47、 conserved across all aerobic organisms uMix of variable and conserved regions uLargest of the three CO subunits uBroad spectrum of substitutional rates 菌物常用的靶标基因菌物常用的靶标基因核糖体基因包括核糖体基因包括5S、5.8S、18S、28S在内的在内的4个个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列。复序列。编码编码18S、5.8S和和28S的的rDNA作为作为1个转录单个转录单 元，

48、元，以中等重复的串联形式存在于染色体以中等重复的串联形式存在于染色体 上。上。18S(SSU)5.8S28S(LSU)IGSITSITS1 1ITSITS2 2IGS53IGS，基因间隔区（，基因间隔区（intergenic region spacer）；）；ITS，内转录间隔区（，内转录间隔区（internal transcribed spacer）ITS5ITS1ITS3ITS2ITS4ITS4-BrDNA（核糖体（核糖体DNA）基因的）基因的结结构构图图ITS作为DNA条形码的优点（1）ITS两两侧侧序列保守便于序列保守便于设计设计通用引物，可广泛通用引物，可广泛应应用用于于 PCR 扩

49、扩增增；（2）ITS的高重复度有利于从微量的高重复度有利于从微量DNA 样样品中品中进进行行检测检测（3）ITS可可应应用于同属近用于同属近缘缘种及种内的种及种内的进进化关系研究化关系研究；IGS（Intergenic spacer，核糖体基因内间隔区）序，核糖体基因内间隔区）序列：分开每个重复序列的列：分开每个重复序列的DNA片段。片段。相对于相对于ITS 区，区，IGS是一个高变区是一个高变区,它们常用于属内它们常用于属内种间比较或种内群体比较。种间比较或种内群体比较。beta tubulinActinRNA polymerase II large subunit,RPB1Translat

50、ion elongation factor 1-Ypt1.菌物常用的靶标基因菌物常用的靶标基因List of primers reported for the identification and detection of Phytophthora species known to threaten forests and other natural ecosystems.线粒体线粒体DNA是真核生物细胞核外一种呈环状的小是真核生物细胞核外一种呈环状的小分子双链分子双链DNA，单拷贝，不含基因间隔区和内含子，单拷贝，不含基因间隔区和内含子，进化历史简单明了，酶切位点少，易于分析。进化历史简单明