《显微摄影技术》PPT课件.ppt
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1、显微摄影技术显微摄影技术廖继东电话:电话:什么是显微摄影?什么是显微摄影?n n 显微摄影:显微摄影:利用摄影装置(传统相机、数码相利用摄影装置(传统相机、数码相机、专用机、专用CCD等)拍摄显微镜视野中所等)拍摄显微镜视野中所观察到的物像。观察到的物像。n n影像质量取决于:影像质量取决于:样本制作质量样本制作质量样本制作质量样本制作质量;显微镜光学性能;显微镜光学性能;显微镜光学性能;显微镜光学性能;摄影装置性能;摄影装置性能;摄影装置性能;摄影装置性能;操作者技术水平。操作者技术水平。操作者技术水平。操作者技术水平。内内 容容n n光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n
2、n光学显微镜主要光学部件及性能光学显微镜主要光学部件及性能n n与显微摄影有关的基本光学概念与显微摄影有关的基本光学概念 n n显微摄影系统的基本构成显微摄影系统的基本构成n n显微摄影基本操作程序显微摄影基本操作程序n n影响显微成像质量的因素影响显微成像质量的因素光学显微镜种类及结构特征光学显微镜种类及结构特征n n按照其按照其按照其按照其光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式光路结构、分辨模式:正置显微镜正置显微镜正置显微镜正置显微镜 倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜 体视镜体视镜体视镜体视镜 偏光镜等;偏光镜等;偏光镜等;偏光镜等;n n按照其照明按照其照明按照
3、其照明按照其照明光源性质光源性质光源性质光源性质:可见光(明视场、弱视场)可见光(明视场、弱视场)可见光(明视场、弱视场)可见光(明视场、弱视场)荧光(紫外、红外)显微镜荧光(紫外、红外)显微镜荧光(紫外、红外)显微镜荧光(紫外、红外)显微镜 激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光谱显微镜;光谱显微镜;光谱显微镜;光谱显微镜;n n按机械部件的按机械部件的按机械部件的按机械部件的控制方式控制方式控制方式控制方式:手动手动手动手动 电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。电动和全自动显微镜。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n
4、n明视场明视场明视场明视场(可见光)(可见光)(可见光)(可见光)照明光源采用照明光源采用照明光源采用照明光源采用普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素普通灯泡或卤素灯灯灯灯,主要用于常规染色组织标本的观察:,主要用于常规染色组织标本的观察:,主要用于常规染色组织标本的观察:,主要用于常规染色组织标本的观察:组织化学染色样本组织化学染色样本组织化学染色样本组织化学染色样本 免疫组织化学染色样本;免疫组织化学染色样本;免疫组织化学染色样本;免疫组织化学染色样本;n n弱视场弱视场弱视场弱视场包括相差(又称相忖)、霍夫曼、微分干包括相差(又称相忖)、霍夫曼、微分干包括相差(又称相忖)、霍夫曼、
5、微分干包括相差(又称相忖)、霍夫曼、微分干涉和偏光等,照明光源与明视场通用,但在光路涉和偏光等,照明光源与明视场通用,但在光路涉和偏光等,照明光源与明视场通用,但在光路涉和偏光等,照明光源与明视场通用,但在光路上插入不同的光学部件,降低背景光强度,增强上插入不同的光学部件,降低背景光强度,增强上插入不同的光学部件,降低背景光强度,增强上插入不同的光学部件,降低背景光强度,增强被观察物体的光反差,提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差,提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差,提高对透明样本的观察能被观察物体的光反差,提高对透明样本的观察能力,主要用于活组织未染色样本的观察。力,主要用于活组织
6、未染色样本的观察。力,主要用于活组织未染色样本的观察。力,主要用于活组织未染色样本的观察。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n荧光荧光显微镜:显微镜:照明光源采用照明光源采用照明光源采用照明光源采用汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯汞灯或高能氙灯,通过不同的,通过不同的,通过不同的,通过不同的滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发滤光片组合获得不同波段的激发/发射光,发射光,发射光,发射光,用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。用于荧光染色标本的观察。由于冷光源技术(由于冷光源技术(由
7、于冷光源技术(由于冷光源技术(金属卤素灯)金属卤素灯)金属卤素灯)金属卤素灯)的开发及荧的开发及荧的开发及荧的开发及荧光蛋白技术的日臻成熟,已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟,已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟,已逐渐克服了强光光蛋白技术的日臻成熟,已逐渐克服了强光源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶颈,使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈,使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈,使荧光显微技术在活组织样本观察中获颈,使荧光显微技术在活组织样本观察中获得了广泛的应用。得了广泛的
8、应用。得了广泛的应用。得了广泛的应用。光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n激光共聚焦显微镜:激光共聚焦显微镜:利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多焦面扫描,通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描,通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描,通过计算机处理合成高清晰图像。焦面扫描,通过计算机处理合成高清晰图像。n n光谱显微镜:光谱显微镜:采用多滤片组合或分光技术,获得连续激发采用多滤片组合或分光技术,获得连续激发采用多滤片组合或分光技术,获得连续激发采用多滤片组
9、合或分光技术,获得连续激发/发射光谱,用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱,用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱,用于荧光扫描、荧光萃灭、荧发射光谱,用于荧光扫描、荧光萃灭、荧光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察光能量转移等细胞动力学观察内内 容容n n光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜的种类及结构特征n n光学显微镜主要光学部件及性能光学显微镜主要光学部件及性能n n与显微摄影有关的基本光学概念与显微摄影有关的基本光学概念 n n显微摄影系统的基本构成显微摄影系统的基本构成n n显微摄影基本操作程序显微摄影基本操作程序n n影响显微成像质量的因素影响显
10、微成像质量的因素光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜成像原理显微镜成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数透镜及其性能透镜及其性能n n透镜透镜(lens):透镜是由透明物质(如玻璃等)透镜是由透明物质(如玻璃等)制成的一种光学元件。制成的一种光学元件。n n透镜是折射镜,其折射面是两个球面,或一透镜是折射镜,其折射面是两个球面,或一个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚像。像。n n透镜一般可以分为两大类:透镜一般可以分
11、为两大类:凸透镜凸透镜和和凹透镜凹透镜。中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜,有双凸、中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜,有双凸、平凸、凹凸三种;中央部分比边缘部分薄的平凸、凹凸三种;中央部分比边缘部分薄的叫凹透镜,有双凹、平凹、凸凹三种。叫凹透镜,有双凹、平凹、凸凹三种。n n凸透镜凸透镜具有会聚光线的作用,所以也叫会聚具有会聚光线的作用,所以也叫会聚透镜。透镜。n n凹透镜凹透镜具有发散光线的作用,所以也叫发散具有发散光线的作用,所以也叫发散透镜。透镜。n n透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件,物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个元件,物镜、目镜及聚光镜等部
12、件均由单个或多个透镜组成。或多个透镜组成。n n虚像虚像/实像实像:光线通过凹透镜后,成正立虚:光线通过凹透镜后,成正立虚像,而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕像,而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来,而虚像不能。上显现出来,而虚像不能。n n焦点与焦平面焦点与焦平面:当一束平行于光轴当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点,这的光线通过凸透镜后相交于一点,这个点称个点称“焦点焦点”;通过交点并垂直光;通过交点并垂直光轴的平面,称轴的平面,称“焦平面焦平面”。焦点有两。焦点有两个,在物方空间的焦点,称个,在物方空间的焦点,称“物方焦物方焦点点”,该处的焦平面,称,该处的焦平面,称“
13、物方焦平物方焦平面面”;反之,在像方空间的焦点,称;反之,在像方空间的焦点,称“像方焦点像方焦点”,该处的焦平面,称,该处的焦平面,称“像方焦平面像方焦平面”。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数显微镜的成像原理显微镜的成像原理n na.a.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在像方二当物体位于透镜物方二倍焦距以外时
14、,则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像;倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像;倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像;倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像;n nb.b.当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在像方二倍当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像;焦距上形成同样大小的倒立实像;焦距上形成同样大小的倒立实像;焦距上形成同样大小的倒立实像;n nc.c.当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则当物体位于透
15、镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像倒立实像倒立实像倒立实像;n nd.d.当物体位于透镜物方焦点上时,则像方不能成像;当物体位于透镜物方焦点上时,则像方不能成像;当物体位于透镜物方焦点上时,则像方不能成像;当物体位于透镜物方焦点上时,则像方不能成像;n ne.e.当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无像的当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也
16、无像的形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的的的的直立虚像直立虚像直立虚像直立虚像。显微镜的成像原理就是利用上述(显微镜的成像原理就是利用上述(c)和)和(e)的规律把物体放大的。当物体处在物镜前)的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F(F为物方焦距)之间,则在物镜像方的为物方焦距)之间,则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上,将此像落在目镜的一倍焦距的设计上,将此像落在目镜的一
17、倍焦距F1之内,之内,使物镜所放大的第一次像(中间像),又被目使物镜所放大的第一次像(中间像),又被目镜再一次放大,最终在目镜的物方(中间像的镜再一次放大,最终在目镜的物方(中间像的同侧)、人眼的明视距离(同侧)、人眼的明视距离(250mm)处形成)处形成放大的直立(相对中间像而言)虚像。因此,放大的直立(相对中间像而言)虚像。因此,当我们在镜检时,通过目镜(不另加转换棱镜)当我们在镜检时,通过目镜(不另加转换棱镜)看到的像于原物体的像,方向相反。看到的像于原物体的像,方向相反。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n n影响成像的关键
18、因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n 色差色差色差色差(ChromaticChromatic aberrationaberration):):):):色差是透色差是透色差是透色差是透镜成像的一个严重缺陷,发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷,发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷,发生在以多色光为光镜成像的一个严重缺陷,发生在以多色光为光源的情况下,单色光不产生色差。白光由红源的情况下,单色光不产生色差。白光由红源的情况下,单色光不产生色差。白光由红源的情况下,单色
19、光不产生色差。白光由红 橙橙橙橙 黄黄黄黄 绿绿绿绿 青青青青 蓝蓝蓝蓝 紫紫紫紫 七种组成,各种光的波长不同七种组成,各种光的波长不同七种组成,各种光的波长不同七种组成,各种光的波长不同,所以在通过透镜时的折射率也不同,这样物,所以在通过透镜时的折射率也不同,这样物,所以在通过透镜时的折射率也不同,这样物,所以在通过透镜时的折射率也不同,这样物方一个点,在像方则可能形成一个方一个点,在像方则可能形成一个方一个点,在像方则可能形成一个方一个点,在像方则可能形成一个色斑色斑色斑色斑。色差色差色差色差一般有位置色差,放大率色差。位置色差使像一般有位置色差,放大率色差。位置色差使像一般有位置色差,放
20、大率色差。位置色差使像一般有位置色差,放大率色差。位置色差使像在任何位置观察,都带有色斑或晕环,使像模在任何位置观察,都带有色斑或晕环,使像模在任何位置观察,都带有色斑或晕环,使像模在任何位置观察,都带有色斑或晕环,使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。n n球差球差(Sphericalaberration):球差是轴上球差是轴上点的单色相差,是由于透镜的球形表面造成的。点的单色相差,是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是,一个点成像后,不再是个球差造成的结果是,一个点
21、成像后,不再是个亮点,而是一个中间亮亮点,而是一个中间亮边缘逐渐模糊的边缘逐渐模糊的亮斑亮斑。从而影响成像质量。从而影响成像质量。球差的矫正常利用透镜球差的矫正常利用透镜组合来消除,由于凸、凹透镜的球差是相反的,组合来消除,由于凸、凹透镜的球差是相反的,可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜,物镜的球差没有完全矫正,应旧型号显微镜,物镜的球差没有完全矫正,应与相应的补偿目镜配合,才能达到纠正效果。与相应的补偿目镜配合,才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。n n慧差慧差(Coma):慧
22、差属轴外点的单色相差。慧差属轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时,发出的光束通轴外物点以大孔径光束成像时,发出的光束通过透镜后,不再相交一点,则一光点的像便会过透镜后,不再相交一点,则一光点的像便会得到得到一逗点壮一逗点壮,型如慧星,故称,型如慧星,故称“慧差慧差”。n n像散像散(Astigmatism):):像散也是影响清晰像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时,边缘上度的轴外点单色相差。当视场很大时,边缘上的物点离光轴远,光束倾斜大,经透镜后则引的物点离光轴远,光束倾斜大,经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并
23、且相互垂直的短线,在理想像平面上综分离并且相互垂直的短线,在理想像平面上综合后,形成一个合后,形成一个椭圆形的斑点椭圆形的斑点。像散是通过复。像散是通过复杂的透镜组合来消除。杂的透镜组合来消除。n n场曲场曲(Curvatureoffield):):场曲又称场曲又称“像像场弯曲场弯曲”。当透镜存在场曲时,整个光束的交。当透镜存在场曲时,整个光束的交点不与理想像点重合,虽然在每个特定点都能点不与理想像点重合,虽然在每个特定点都能得到清晰的像点,但整个像平面则是一个曲面。得到清晰的像点,但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时这样在镜检时不能同时看清整个相面不能同时看清整个相面,给观察,给观察和照相
24、造成困难。因此研究用显微镜的物镜一和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是般都是平场物镜平场物镜,这种物镜已经矫正了场曲。,这种物镜已经矫正了场曲。n n畸变畸变(Distortion):):前面所说各种相差除前面所说各种相差除场曲外,都影响像的清晰度。畸变是另一种性场曲外,都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的相差,光束的同心性不受到破坏。因此,质的相差,光束的同心性不受到破坏。因此,不影响像的清晰度,但使像与原物体比,在形不影响像的清晰度,但使像与原物体比,在形状上造成失真。状上造成失真。光学显微镜主要光学部件及性能n n透镜及其性能透镜及其性能n n显微镜的成像原理显微镜的成像原理n
25、 n影响成像的关键因素影响成像的关键因素相差相差n n主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n光学显微镜相关参数光学显微镜相关参数主要光学部件及性能主要光学部件及性能n n物镜物镜(objective):物镜是显微镜最物镜是显微镜最主要的光学部件,显微镜的分辩力主主要的光学部件,显微镜的分辩力主要取决于物镜的数值孔径(镜口率,要取决于物镜的数值孔径(镜口率,numerical aperture,NA)。)。n n目前常见物镜:消色差物镜、复消色目前常见物镜:消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜。差物镜。数值孔径数值孔径(NA)n n数值孔径
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