第八章-微生物遗传课件.pptx

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1、第八章微生物遗传第八章微生物遗传第一节 遗传的物质基础第二节 质粒和转座子第三节 诱发突变Ams实验第四节 微生物育种一一.DNA作为遗传物质作为遗传物质1.Griffith的转化的转化试验试验（1928年）年）2.3.二二.RNA作为遗传物质作为遗传物质一一.质粒质粒 一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb（细菌质粒多在10kb以内）。1.质粒的分子结构质粒的分子结构 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中，也发现有线型双链DNA

2、质粒和RNA质粒。2.质粒的分离质粒的分离碱提取法：碱提取法：菌体的培养和收集：菌体的培养和收集：一般采用丰富培养基对菌体进行培养，一般采用丰富培养基对菌体进行培养，当细胞生长到当细胞生长到指数期后期指数期后期时，离心收集细胞。时，离心收集细胞。溶菌：溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生质体或原生质球。一般用溶菌酶去壁以形成原生质体或原生质球。碱变性处理：碱变性处理：在在SDSSDS等表面活性剂存在下加等表面活性剂存在下加NaOHNaOH液使液使pHpH升升至至12.412.4，可使菌体蛋白质、染色体，可使菌体蛋白质、染色体DNADNA以及质粒以及质粒DNADNA变性。变性。质粒复性：质粒复性：加

3、入加入pH4.8pH4.8的的KAc-HAcKAc-HAc缓冲液，将提取液调至中缓冲液，将提取液调至中性性，由于质粒分子量小而容易复性，并稳定存在于溶液中；染，由于质粒分子量小而容易复性，并稳定存在于溶液中；染色体色体DNADNA分子量太大，在复性过程中形成分子量太大，在复性过程中形成DNADNA之间的交联导之间的交联导致其形成更大分子的不溶性物质。致其形成更大分子的不溶性物质。离心分离：离心分离：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白及染色体及染色体DNADNA一起沉淀一起沉淀3.质粒的特性质粒的特性（1 1）位于核基因组外，以）位于核基因组外，

4、以cccDNA方式存在；（2 2）有的质粒可整合到核染色体上；）有的质粒可整合到核染色体上；（3 3）可重组（质粒与质粒间，质粒与染色体间）；）可重组（质粒与质粒间，质粒与染色体间）；（4 4）人为消除（高温、丫叮类，）人为消除（高温、丫叮类，UVUV，电离辐射，电离辐射，利福平等）；利福平等）；（5 5）有的质粒可在细胞间转移（）有的质粒可在细胞间转移（F F因子，因子，R R因子）因子）（6 6）质粒具有不亲和性）质粒具有不亲和性质粒的不亲和性（质粒的不亲和性（plasmid plasmid incompatibilityincompatibility），），有时也称为不相容性，是指在没有

5、选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。4.质粒的主要类型质粒的主要类型根据质粒所根据质粒所编码的功能编码的功能和赋予宿主和赋予宿主的表型效应的表型效应分类分类:致育因子致育因子（Fertility factorFertility factor，F F因子）因子）抗性质粒抗性质粒（Resistance factorResistance factor，R R因子）因子）产细菌素的质粒产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmidB

6、acteriocin production plasmid）毒性质粒毒性质粒（virulence plasmidvirulence plasmid）代谢质粒代谢质粒（Metabolic plasmidMetabolic plasmid）隐秘质粒隐秘质粒（cryptic plasmidcryptic plasmid）(1 1)致育因子致育因子(Fertility factorFertility factor，F F因子因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当

7、于雌性）。F F因子能以游离状态因子能以游离状态(F+)F+)和和以与染色体相结合的状态以与染色体相结合的状态(Hfr)Hfr)存在于细胞中，所以存在于细胞中，所以又称之为又称之为附加体附加体(episome)episome)。在志贺氏菌属（在志贺氏菌属（ShigellaShigella）、沙门氏菌属（）、沙门氏菌属（SalmonellaSalmonella）和链）和链球菌属（球菌属（StreptococcusStreptococcus）等其他细菌中也发现了与大肠杆菌）等其他细菌中也发现了与大肠杆菌类似的致育因子。类似的致育因子。在放线菌中，天蓝色链霉菌含有在放线菌中，天蓝色链霉菌含有SCP1

8、SCP1和和SCP2SCP2两种致育质粒，两种致育质粒，这两种质粒在天蓝色链霉菌的接合过程中起重要作用，带动这两种质粒在天蓝色链霉菌的接合过程中起重要作用，带动染色体从供体细胞向受体细胞转移。染色体从供体细胞向受体细胞转移。(2)抗性因子（抗性因子（Resistance factorResistance factor，R R因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。R100 R100质粒质粒(89(89kb)kb)可使宿主对可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion mercuric ion，mermer）四环素（四环素（tetra

9、cyclinetetracycline，tettet ）链霉素链霉素(Streptomycin,Streptomycin,strstr)、磺胺磺胺(Sulfonamide,Sulfonamide,sulsul)、氯霉素氯霉素(Chlorampenicol,Chlorampenicol,cmlcml)夫西地酸（夫西地酸（fusidic acidfusidic acid，fusfus）负责这些抗性的基因是成簇负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上地存在于抗性质粒上。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。有的质粒可携带多达10种抗生素的基因。抗性质粒可以在关系相近或关系疏远的菌种

10、间转移。(3 3)Col Col 质粒：产细菌素的质粒质粒：产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmidBacteriocin production plasmid）细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素：细菌素：许多细菌都能产生某些代谢产物，抑制或杀死其他近缘细菌许多细菌都能产生某些代谢产物，抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株，因为这些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不象抗或同种不同菌株，因为这

11、些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不象抗生素那样具有很广的杀菌谱，所以称为细菌素（生素那样具有很广的杀菌谱，所以称为细菌素（bacteriiocinbacteriiocin）细菌素种类很多细菌素种类很多,一般根据产生菌的种类进行命名：一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）产生的细菌素为产生的细菌素为colicinscolicins（大肠杆菌素）大肠杆菌素），而质粒被称为，而质粒被称为ColCol质粒。此外还有枯草杆菌素、乳酸菌素、质粒。此外还有枯草杆菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。根瘤菌素等。由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，

12、但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinANisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。大肠杆菌素产自大肠杆菌的一种蛋白质，具有专一性地杀大肠杆菌素产自大肠杆菌的一种蛋白质，具有专一性地杀死其亲缘关系很近的、不具死其亲缘关系很近的、不具ColCol质粒的其它肠道细菌的功能。质粒的其它肠道细菌的功能。(4 4)毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmidvirulence plasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动

13、物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子(5 5)代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmidMetabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。放线菌）等。降解质粒降解质粒：能能将将复杂的有机化合物降解成能被其作为复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式碳源和能源利

14、用的简单形式，环境保护方面具有重要环境保护方面具有重要的意义。如的意义。如TOLTOL质粒：含分解甲苯的基因；质粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCTCAM-OCT质粒：含分解樟脑辛烷的基因质粒：含分解樟脑辛烷的基因假单胞菌：假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯苯)、农药、农药(二氯苯氧基乙酸二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟脑等的能力辛烷和樟脑等的能力。根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：高拷贝数高拷贝数(high copy number)high copy number)质粒质粒（每个细胞中可以有10100个拷贝,

15、其复制和染色体的复制不同步）如ColE1、ColE2等 松弛型质粒松弛型质粒(relaxed plasmid)relaxed plasmid)低拷贝数低拷贝数(low copy number)low copy number)质粒质粒（每个细胞中只有12个拷贝,其复制行为与染色体的复制同步）如F因子，R100 严谨型质粒严谨型质粒(stringent plasmidstringent plasmid)窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）（只能在一种特定的宿主细胞中复

16、制）广宿主范围质粒广宿主范围质粒(broad host range plasmid)broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）二二.转座因子转座因子 细胞中能改变自身位置的一段DNA称为转座因子。原核生物的转座因子包括插入序列、转座子和某些特殊病毒。（一）转座因子的种类（一）转座因子的种类1.插入序列（插入序列（insertion sequence）IRTransposase GeneIR二个分离的反向末端重复序列二个分离的反向末端重复序列 (inverted terminal repeats,ITR)(inverted terminal repeats,IT

17、R)一个转座酶（一个转座酶（transposase)transposase)编码基因编码基因 2.转座子转座子复合转座子 类转座子 由IS类转座组件构成的复合体。组成：两端为IS，中间编码抗生素物质复杂转座子类转座子（Tn A家族）携带转座和耐药等基因的独立体家族。组成：两端为ITR，而不是IS，中间编码区含转座酶编码基因，及抗生素抗性和解离酶等编码基因。IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座因子的遗传学效应（二）转座因子的遗传学效应1.插入突变l插到某一基因中，导致该基因突变l插到操纵子前半段，引起极性突变l插入抗性基因引起抗性突变2.染色体畸变3.基因的移动和重

18、排一一.诱发突变诱发突变 自发突变的频率是很低的，一般为106-10-10。许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频率，将这些能使突变频率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂。已知的化学致变剂和物理致变剂 物理致变剂物理致变剂致变剂致变剂电离辐射、紫外辐射等 化学致变剂化学致变剂 脱氨剂、烷化剂、大型加合物供体、碱基类似物、插入剂、交联剂。诱变剂导致表型改变诱变剂导致表型改变营养缺陷型营养缺陷型营养缺陷型：营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基上生长，这类突变菌株就是营养缺陷型。基本培养基：基本培养基：仅能满足

19、野生型菌株生长需要的最低成分组合的培养基。完全培养基：完全培养基：可满足营养缺陷型菌株营养需要的培养基。二二.诱变剂与致癌物诱变剂与致癌物Ames试验试验埃姆斯实验埃姆斯实验1.鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型2.基本培养基3.鼠肝匀浆4.可疑“三致”样品实验步骤实验步骤1.用基本培养基到平板2.将鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型培养液涂在平板上3.将“三致”样品和鼠肝匀浆混合吸附在滤纸片上，放在平板中央。4.培养2天后看结果。阳性结果阴性结果诱变育种诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（对象内的遗传物质（DNADNA）的分子结构发）的分子结构发生改变，引起性

20、状变异并通过筛选获得符合生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种的实践意义诱变育种的实践意义：当前发酵工业和其他：当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。产性能的。1.选择选择合适的出发菌株选择选择合适的出发菌株2.制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液3.诱变处理诱变处理4.筛选筛选5.保藏和扩大试验保藏和扩大试验诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具

21、备：出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株。1.出发菌株的选择出发菌株的选择要求：要求：菌体处于菌体处于对数生长期对数生长期细胞分散且为细胞分散且为单细胞单细胞方法：方法：玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min;10-15min;加加.3%.3%吐温吐温8080（表面活性剂）（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。用无菌脱脂棉过滤。制备：制备：物理诱变剂物理诱变剂生理盐水（生理盐水（0.85%NaCl)0.85%NaCl)化学诱变剂化学诱变剂缓冲液缓冲液 浓度：浓度：细菌

22、、放线菌细菌、放线菌 10108 8个个/ml/ml，霉菌、酵母菌，霉菌、酵母菌 10106 6个个/ml/ml2.2.制备细胞悬液制备细胞悬液选择合适的诱变剂量：选择合适的诱变剂量：不同不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。示方法。最适剂量的选择：最适剂量的选择：产量产量性状的育种中多倾

23、向于低剂量（致死率在性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在707080%80%）。）。3.3.诱变处理诱变处理选择诱变剂的种类选择诱变剂的种类：在同样效果下，应选用在同样效果下，应选用最方便最方便的因素；在同样方的因素；在同样方便的情况下，则应选择便的情况下，则应选择最高效最高效的因素。在物理诱变剂的因素。在物理诱变剂中，尤以中，尤以紫外线紫外线为最方便，在化学诱变剂中，一般可为最方便，在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的选用诱变效果最为显著的“超诱变剂超诱变剂”，如，如NTGNTG。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌

24、株细胞，然后在平板上均匀地先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。出法选出突变种。（1 1）筛选方案：）筛选方案：初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似

25、的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。简单。复筛：确认符合要求的菌株；复筛：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。应精确测定每个菌株的生产指标。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.4.菌种筛选温度敏感突变株温度敏感突变株筛选方法：影印法筛选方法：影印法用用途途：常常用用于于提提高高代代谢谢物产量物产量原原因因：是是由由于于某某一一酶酶蛋蛋白白结结构构

26、改改变变后后，在在高高温下活力丧失温下活力丧失（2 2）突变株筛选举例）突变株筛选举例v由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌22562256，经，经诱变处理得到温度敏感变异株诱变处理得到温度敏感变异株Ts88:Ts88:3030培养时能正常生长培养时能正常生长4040是死亡，但能在富含生物素的培养基中是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。制）。v在富含生物素的培养基中进行发酵时：在富含生物素的培养基中进行发酵时：先在先在3030（允许条件）中进行培养以得到大（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，

27、适当时间后提高温度（量菌细胞，适当时间后提高温度（40 40，非，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：v作为菌株的遗传标记作为菌株的遗传标记v作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选抗生素浓缩抗生素浓缩原理：原理：青霉素、制青霉素、制霉菌素等抗生素作霉菌素等抗生素作用于生长着的微生用于生长着的微生物细胞，对休止态物细胞，对休止态细胞无作用。细胞无作用。方法：方法：将菌培养在将菌培养在含抗生素含抗生素的基本培的基本培

28、养基养基中。中。u适用于适用于：丝状丝状（放线菌、霉菌）（放线菌、霉菌）u原理：原理：野生型在野生型在基本培养基上发基本培养基上发育成菌丝；缺陷育成菌丝；缺陷型孢子可通过滤型孢子可通过滤膜，野生型菌丝膜，野生型菌丝不能通过不能通过。菌丝过滤法浓缩菌丝过滤法浓缩逐个检出法逐个检出法营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出 影印平板培养法影印平板培养法生长谱法生长谱法方法简便；方法简便；回变和污染不影响回变和污染不影响 结果结果 测定物质可为粉末测定物质可为粉末 或纸片或纸片缺陷型的鉴定v作为菌株的遗传标记：进行基因工程、作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变诱变育种；育种；v研究代谢过程时用作亲本标记研究代谢过程时用作亲本标记；v作为作为生产菌种：生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；、核苷酸等生产菌种；v作为作为aa、维生素、碱基的测定菌株。、维生素、碱基的测定菌株。缺陷型的应用总结总结1.基本概念：质粒，转座因子，营养缺陷型，接合，转导，转化，诱变育种2.基本理论：（1）遗传的物质基础实验（2）Ames实验3.基本技能：突变株的筛选