荧光定量PCR实验技术干货课件.ppt

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1、荧光定量荧光定量PCR技术及数据处理分析技术及数据处理分析项目部项目部内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR的原理的原理荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法荧光定量实验流程荧光定量实验流程荧光定量荧光定量PCR仪仪生工荧光定量产品选择指南生工荧光定量产品选择指南2荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义实时定量实时定量PCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩每一个循环扩增产物量的变化增产物量的变化，对，对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分

2、析，扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起无法对起始模板准确定量始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测，无法对扩增反应实时检测3荧光定量荧光定量PCR原理原理标记方法标记方法4SYBR Green I4TaqMan Probe分子信标分子信标SYBR Green I 染料法染料法SYBR Green I5SYBR Green I是一种结合于所有是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。绿色激发波长的染料。SYBR Green ISYBR Green I5SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理6 6SYBR Green I 染料

3、法染料法融解曲线融解曲线7将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱7SYBR Green I 染料法染料法融解曲线融解曲线8融解曲线分析，单一融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：峰无非特异性荧光：定量准确定量准确融解曲线分析，出现融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非杂峰其他产物出现非特异性荧光：特异性荧光：定量不准确定量不准确8Taqman 探针法探针法原理原理95端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter,R)，如，如FAM、VIC等等 3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，MGB 为不发光的荧

4、光基团为不发光的荧光基团探针完整，探针完整，R发射的荧光能量被发射的荧光能量被Q基团吸收基团吸收，无荧光，无荧光，R与与Q分开，发荧光分开，发荧光Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针，外切核酸酶活性，可水解探针，R与与Q分开，发荧光。分开，发荧光。9Taqman 探针法探针法工作机理工作机理10热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引

5、物R RR RR RR R10Taqman 探针法探针法PCRPCR体系的建立体系的建立1.引物、探针的设计：引物、探针的设计：探针探针Tm为为68-70,30 bp,5不能有不能有G,G可能会淬灭荧光素可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针引物尽量靠近探针,扩增片段扩增片段400 bp,引物引物Tm为为59-602.反应参数的确定：反应参数的确定：一般为：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度最高），也可通过温度梯度优化退火温度3.优化引物和探针浓度：获得最小优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信

6、号值，最大信号/背景比值背景比值引物浓度：引物浓度：100-900nM探针浓度：探针浓度：50-300nM4.其他与常规其他与常规PCR相同相同1111实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信标12标记荧光的发夹探针标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补环与目标序列互补茎由互补配对序列组成茎由互补配对序列组成环环茎茎荧光素荧光素 淬灭剂淬灭剂12实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信标13FRET13几种荧光定量几种荧光定量PCR方法的应用比较方法的应用比较1414荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念+扩增曲线扩增曲线+荧光阈值荧光阈值+Ct值值151

7、5荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线16Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件16荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光阈值荧光阈值17Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期前前15个循环信号作为荧光本底个循环信号作为荧光本底信号（信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是荧光阈值的缺省设置是315个个循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的10倍倍手动设置手动设置:大于荧光背景值和阴大

8、于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段数期的最初阶段真正的信号真正的信号:荧光信号超过阈值荧光信号超过阈值Threshold17荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值18Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct值的定义：值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数时所经过的扩增循环次数Ct value 18荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值的重现性值的重现性19横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量Ct值的特

9、点：值的特点：相同模板进行相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性值极具重现性19荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理20理想的理想的PCR反应反应XnX0 2n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数20荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理21非理想的非理想的PCR反应反应 XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循

10、环数En：扩增效率：扩增效率21荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理22在扩增产物达到荧光阈值时在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 *（1En）CtM （1）整理方程式（整理方程式（2）：）：方程式（方程式（1）两边同取对数得：）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为它是一个常数，定为MLog2MLog2X0*（1En）Ct （2）Log2X0=Log 2M-Ct Log2（1En）22荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与起始模板量的关系值与起始

11、模板量的关系23Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration模板模板DNA量越多，荧光达量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即到阈值的循环数越少，即Ct值越小。值越小。Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值值呈线性关系。呈线性关系。23荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量反应性的确认荧光定量反应性的确认24线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认相关系数（相关系数（R2）：大于）：大于0.98标准曲线斜率：标准曲线斜率：-3 -3.5PCR扩增效率（扩增效率（E）：）：0.9-1.2检测灵敏度确认检测灵敏度确认35Cycles

12、内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用如果采用SYBR检测方法，检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增No template control确认确认35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生24荧光定量荧光定量PCR技术的主要应用技术的主要应用定性分析研究定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等）分析等绝对定量研究绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等定量检测等相对定量研究相对定量研究：mRNA表达量分析，表达量分析，siRNA效果确认，差效果

13、确认，差异显示结果验证等异显示结果验证等2525荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1绝对定量解析方法绝对定量解析方法1相对定量解析方法相对定量解析方法2626绝对定量的定义绝对定量的定义27Sample25Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品标准品 可作出标准曲线可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量值，就可以计算出样品中所含的模板量27绝对定量分析几要素绝对定量分析几要素28一个一个目的基因目的基因 即需要确定其量

14、值的核酸序列。即需要确定其量值的核酸序列。一组一组标准样本标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组产物、基因组DNA等。等。重复反应孔重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。计显著性。标记方法的选择标记方法的选择 SYBR Green I 法或法或Taqman 探针法均可。探针法均可。实验结果显示实验结果显示 扩增曲线；标准曲线；融解曲线扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要探针法不需要)。28绝对定量质粒标准品的制备绝对定量质粒标准品的制备29

15、PCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒目的基因目的基因目的基因目的基因基因组基因组DNA质粒提取，质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用29质粒标准品稀释方法质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液原液(标准品标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品稀

16、释缓冲液，得标准品v30绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量31方法：方法：检测毕赤酵母的检测毕赤酵母的A基因基因标准品：标准品：质粒标准品浓度为质粒标准品浓度为5个浓度；个浓度；3个重复；设阴性空白对照个重复；设阴性空白对照实验步骤：实验步骤：提取提取A DNA；设计特异引物；设计特异引物；设计设计TaqMan探针并标记探针；探针并标记探针；荧光定量扩增；荧光定量扩增；结果分析：获取毕赤酵母的结果分析：获取毕赤酵母的A的精确的精确copy数。数。31绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量3232绝对定量实验例绝

17、对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量33扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E=10-1/斜率斜率 -1 =10-1/-3.481 -1 =1.983-1 =0.938标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y=-3.481x+40.123 R2=0.9996 相关系数（相关系数（相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近，越接近，越接近1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（扩增效率（扩增效率（E E）：）：

18、）：）：0.8-1.2,0.8-1.2,越接近越接近越接近越接近1 1，越理想。，越理想。，越理想。，越理想。33绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量34未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算将将Ct值带入线性方程：值带入线性方程：18.45=-3.481 X+40.123QuantityUnknown=10 6.226 =1682674 copies X=18.45-40.123-3.481=6.22634相对定量的必要性相对定量的必要性35Sample BSample BSample ASample A目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同RN

19、A提取效率相同提取效率相同细胞起始数相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析35相对定量分析方法相对定量分析方法36比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！36相对定量分析几要素相对定量分析几要素37一个一个参照样本参照样本一个或一个以上的一个或一个以上的未知样本未知样本一个一个目的基因目的基因管家基因管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量用来校对不同样本之间目的基因的实际表达

20、量重复反应孔重复反应孔建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性标记方法的选择标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可法或探针法均可实验结果显示实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）（探针法不需要）一组一组标准样本标准样本（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要）37相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选38管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如：如：GAPDH、Actin、

21、18S rRNA等等筛选方法筛选方法根据文献提供根据文献提供通过具体实验筛选通过具体实验筛选0 01 12 23 34 45 56 6Sample1Sample1 Sample2Sample2 Sample3Sample3 Sample4Sample4实验组实验组实验组实验组实验值实验值实验值实验值-Actin-ActinGAPDHGAPDH-2-microglobulin-2-microglobulinHPRTHPRTP P P P P P O O38相对定量分析相对定量分析两种常用的分析方法两种常用的分析方法39双标准曲线法双标准曲线法2-Ct法法39相对定量分析相对定量分析双标曲线法双标

22、曲线法40通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。公式：公式：相对值相对值=校正值校正值=目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值40相对定量分析相对定量分析双标曲线法双标曲线法41优点：分析点：分析简单，实验优化相化相对简单缺点：缺点：对每一个基因，每一每一个基因，每一轮实验都必需做都必需做标准曲准曲线应用：基因表达用：基因表达调控研究中最

23、常用与公控研究中最常用与公认的两种相的两种相对定量方法之一定量方法之一实验数据实验数据41相对定量分析相对定量分析2 2CtCt法法42假设目标序列与内参序列扩增效率相同：假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或或最后用任一待测样本最后用任一待测样本 q 的的 XN 除以对照样本（除以对照样本（calibrator，cb）的）的 XN 得到：得到：对于一个少于对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果 Mg 2+浓度、引物都进行了适当的优浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于化，扩增效率接近于 1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子。因此目标序列的量

24、通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：而言就是：XT 是目标基因达到设定的阈值时的分子数是目标基因达到设定的阈值时的分子数RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数是内参基因达到设定的阈值时的分子数 42相对定量分析相对定量分析2 2CtCt法法43公式：公式：F=2优点：优点：无需作标准曲线无需作标准曲线缺点：缺点：假定扩增效率为假定扩增效率为 100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂。实验条件优化较为复杂。应用：应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一基因表达调控研究中最常用与公认的两种相

25、对定量方法之一 待测组目的基因待测组目的基因平均平均Ct值值待测组内参基因待测组内参基因平均平均Ct值值对照组目的基因对照组目的基因平均平均Ct值值对照组内参基因对照组内参基因平均平均Ct值值43相对定量分析相对定量分析2 2CtCt法法44实验数据：实验数据：2-Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理前）（处理前）15132 Ct（处理后）（处理后）1820=2 Ct=Ct（处理后）（处理后）Ct（处理前）（处理前）224 比率比率（处理后（处理后/处理前）处理前）2Ct2（4）16 所以所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的

26、基因在处理后表达水平是处理前的16倍倍修正方法：修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于于2，那么，那么2Ct可以修正为：可以修正为：ECt，例如扩增效率为，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修，那么计算公式可修正为正为1.95Ct44荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项45样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机

27、上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法45荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项46样品制备样品制备环境要求环境要求定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定无无RNase环境环境使用无使用无RNase耗材耗材专用专用RNase-free工具工具纯度高、完整性好的纯度高、完整性好的纯度高、完整性好的纯度高、完整性好的RNARNA分光光度计检测分光光度计检测电泳检测电泳检测46荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项47样品制备样品制备试剂选择试剂选择定量体系配备定量体系配备

28、数据分析数据分析RT上机上机反应体系优化反应体系优化AMVM-MLV高效，全长的高效，全长的高效，全长的高效，全长的cDNAcDNA下游反应数确定反转录体积下游反应数确定反转录体积引物的选择引物的选择47荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项48样品制备样品制备误差控制误差控制定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定引物设计引物设计环境要求环境要求使用使用mix降低系统误差降低系统误差设置重复（设置重复（3次）次）设置空白和阴性对照设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反

29、应液和模板混合物制作标准曲线制作标准曲线设定浓度区间设定浓度区间GC：5060Tm：5065单个碱基重复单个碱基重复4个个无二级结构无二级结构扩增长度：扩增长度：100200bp核酸制备区核酸制备区反应液制备区反应液制备区48荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项49样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机反应体系优化反应体系优化反应条件优化反应条件优化标标准准品品待测样本待测样本阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照退火温度优化：梯度退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定延伸时间：产物长度决定反应体积反应体积5ul，推荐，推

30、荐2050ul引物浓度优化，模板量优化引物浓度优化，模板量优化Mg2调节，酶活调节调节，酶活调节扩增效率：扩增效率：90110重复性：重复性：std0.2标准曲线：标准曲线：R0.99或或R2 0.9849荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项50样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机自配自配购买即用型购买即用型RCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分装控制分装控制内参控制内参控制机器校正控制机器校正控制可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据技能要求技能要求误差控制误差控制仪器介绍仪器介绍试剂选择试剂选择50荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项51样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机仪器介绍仪器介绍分析方法分析方法平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高相对定量：相对定量：2Ct法法绝对定量：标准曲线法绝对定量：标准曲线法51