2022年医学专题—细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt

《2022年医学专题—细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年医学专题—细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt（95页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第二篇第二篇 目标产品的分离目标产品的分离(fnl)(fnl)与纯化与纯化第五章第五章 细胞破碎细胞破碎(p su)(p su)、蛋白质复性和固液、蛋白质复性和固液分离分离第一页，共九十五页。细胞细胞(xbo)破破碎碎固液分离固液分离(fnl)初级初级(chj)(chj)分离分离(粗粗)纯化精制纯化精制下游技术基本过程下游技术基本过程第二页，共九十五页。下游加工技术的重要性下游加工技术的重要性 1.1.产品分离纯化是最终获得商业产品分离纯化是最终获得商业(shngy)(shngy)产品的环节。产品的环节。2.2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占酸占60%60%）

2、。）。3.3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。程技术的发展。第三页，共九十五页。几种产品几种产品(chnpn)(chnpn)在发酵液中的浓度在发酵液中的浓度 产品产品 典型浓度（典型浓度（g/Lg/L）抗生素抗生素 2525 氨基酸氨基酸 100100 酒精酒精 100100 有机酸有机酸 100100 酶酶 2020 蛋白质蛋白质 1010第四页，共九十五页。下游加工技术的特点下游加工技术的特点 1.1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定欲提取的产物通常浓度低且很不稳定(wndng

3、)(wndng)。3.3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。要求下游加工有一定弹性。第五页，共九十五页。产物提纯过程的不同决定于：产物提纯过程的不同决定于：对象材料对象材料(cilio)(cilio)、目标产物特性及、目标产物特性及对其纯度的要求对其纯度的要求第一节第一节 概述概述(i sh)(i sh)第六页，共九十五页。基因工程生物制品基因工程生物制品(shn w(shn w zh zh pn)pn)分离分离纯化纯化:工程菌经过工程菌经过(jnggu(jnggu)大规模培养大规模培养后，产生的有效成分含量很低，后，产生的有效成分含量

4、很低，杂质含量却很高杂质含量却很高分离分离(fnl)(fnl)纯纯化极其重化极其重要要基因工程药物从转化细胞、基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求生产，对产品的纯度要求高于传统产品。高于传统产品。第七页，共九十五页。发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物胞外产物胞外产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包涵体包涵体细胞碎片分离细胞碎片分离变性变性复性复性浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品 基因工程制品分离基因工程制品分离(fnl)(fnl)纯化的一般流程纯化的一般流程第八页，共九十五页。初级分离初级分离：分离细胞和培养液，破碎细分离细胞和培养液，破碎

5、细胞释放产物，溶解胞释放产物，溶解(rngji)(rngji)包含体（包涵体）包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂，复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。质等过程。主要决定产物的得率主要决定产物的得率。纯化精制纯化精制：初级分离基础上，用各种高初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度主要决定产物的纯度。产物产物(chnw)提纯过程包括两个基本阶段：提纯过程包括两个基本阶段：第九页，共九十五页。

6、第二节第二节 细胞细胞(xbo)(xbo)破碎破碎目的：目的：释放细胞内含物释放细胞内含物。分类：分类：按照是否存在按照是否存在(cnzi)外加作用外加作用力分为机械法和非机械法。力分为机械法和非机械法。问题问题(wnt)：破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为以大肠杆菌为宿主药物多为宿主药物多为胞内产物胞内产物第十页，共九十五页。破碎方式破碎方式机械法机械法固体剪切作用固体剪切作用珠磨法珠磨法压榨压榨液体剪切作用液体剪切作用高压匀浆高压匀浆超声破碎超声破碎非机械法非机械法干燥处理干燥处理溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法化学法化学法物理法物理法细胞细胞(xbo)破碎方法分类图破碎方法

7、分类图第十一页，共九十五页。1 1、高压、高压(goy)(goy)匀浆法匀浆法组成组成：高压泵和匀浆阀高压泵和匀浆阀作用机理作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大历较高的流速下的剪切碰撞发生较大(jio d)(jio d)的变形，从而达到破碎细胞的目的的变形，从而达到破碎细胞的目的。第十二页，共九十五页。高压高压(goy)匀浆

8、阀结构示意图匀浆阀结构示意图进液口进液口出液口出液口阀座阀座碰撞碰撞(pn(pn zhun)zhun)环环阀杆阀杆高压高压(goy)(goy)匀浆器匀浆器第十三页，共九十五页。19.6-25.4MPa适用于酵母和大多数细菌适用于酵母和大多数细菌(xjn)(xjn)细胞的破碎细胞的破碎第十四页，共九十五页。高压匀浆高压匀浆(yn jin)法动力学方程法动力学方程破碎效率与匀破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数浆阀结构、操作压力和破碎次数有关有关(y u g u n)(y u g u n)：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KNP-R)=KNPa aR R：单位生物量释放出的产物

9、量（：单位生物量释放出的产物量（mg/G)mg/G)R Rm m：R R的最大值；的最大值；K K：破碎速率常数；：破碎速率常数；N N：破碎次数；：破碎次数；P P：操作压力；：操作压力；a:a:与微生物性质有关的指数系数。与微生物性质有关的指数系数。第十五页，共九十五页。破碎率破碎率-操作压力操作压力-温度控制温度控制-能耗能耗温度对活性物质的失活作用温度对活性物质的失活作用提高压力需增加提高压力需增加(zngji)(zngji)能耗：能耗：3.5KW/100MPa3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：移走热量需付出代价：23.8/100MPa23.8/100MPa高压高压(goy)

10、(goy)匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆匀浆(yn jin)(yn jin)过程中产生的热过程中产生的热蛋白质和酶的蛋白质和酶的失活失活温控和能耗温控和能耗第十六页，共九十五页。堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬坚硬(jinyng)者如包含体易损伤匀浆阀，也不者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用适用温度高易失活，能耗大。温度高易失活，能耗大。存在存在(cnzi)的问题的问题第十七页，共九十五页。2 2、高速、高速(o s)(o s)珠磨法珠磨法原理原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨细胞和极细的

11、研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相细胞之间互相(h xing)(h xing)剪切、碰撞剪切、碰撞，促使，促使细胞壁破裂，释放内含物。细胞壁破裂，释放内含物。第十八页，共九十五页。几种几种(j zhn)常见珠磨器常见珠磨器第十九页，共九十五页。动力学方程动力学方程(fngchng)间歇操作间歇操作:Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=Ln(D)=Kt-R)=Ln(D)=Kt 其中，其中，D=(1+KD=(1+K1 1/j)/j)j j连续操作：连续操作：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KV/f=K-R)=KV/

12、f=K上式中，上式中，t t是破碎时间；是破碎时间；K K、K K1 1、KK是破碎速度常是破碎速度常数；数；V V是破碎室内悬浮液的体积；是破碎室内悬浮液的体积；f f是进料速度；是进料速度；是平均是平均(pngjn)(pngjn)停留时间；停留时间；j j是破碎时全混釜是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。第二十页，共九十五页。采用夹套冷却的方式实现温控采用夹套冷却的方式实现温控,效果效果(xiogu)(xiogu)较好较好;能耗与细胞破碎率成正比能耗与细胞破碎率成正比;问题：问题：高压高压(goy)匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？匀浆比珠

13、磨法破碎细胞的效果好？温控和能耗温控和能耗(nn ho)第二十一页，共九十五页。高压匀浆高压匀浆(yn jin)法与高速珠磨法的比较法与高速珠磨法的比较项目项目高压匀浆法高压匀浆法高速珠磨法高速珠磨法操作参数操作参数少少多，液体损耗大多，液体损耗大连续操作时连续操作时配备热换器进行级配备热换器进行级间冷却间冷却兼具破碎和冷却，兼具破碎和冷却，减少产物失活减少产物失活达到较高破碎率达到较高破碎率需循环需循环2-42-4次次一次操作一次操作适用范围适用范围团状、丝状真菌、团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜宜，包含体不宜几乎所有的微生物几乎所有的微生物细胞，包括含有包细胞

14、，包括含有包含体的基因工程菌含体的基因工程菌的破壁的破壁第二十二页，共九十五页。X-PressX-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25-25-30-30，形成冰晶，用，形成冰晶，用500MPa500MPa以上的高压以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损体磨损(m sn)(m sn)和包埋在冰中的细胞变形引起细和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。物活性保持较好。第二十三页，共九十五页。3 3、超声破碎、超声破碎(p su

15、)(p su)机理：机理：声频高于声频高于151520kHz20kHz的超声波在高强度声能的超声波在高强度声能输入时可以进行输入时可以进行(jnxng)(jnxng)细胞破碎，破碎机理尚未清楚，细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与可能与空化现象空化现象引起的冲击波和剪切力有关。引起的冲击波和剪切力有关。破碎效率破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。菌种类型等因素有关。优点优点：操作简便，液量损失少操作简便，液量损失少存在问题存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。量时效率低，应用

16、潜力有限。第二十四页，共九十五页。空化现象空化现象：在强声波作用下，引在强声波作用下，引起气泡形成起气泡形成(xngchng)，胀大和破碎的现，胀大和破碎的现象。象。锡箔纸测试空化强度锡箔纸测试空化强度(qingd)(qingd)与空化密度与空化密度看得到看得到(d do)(d do)的空化现象的空化现象第二十五页，共九十五页。超声波破碎超声波破碎(p su)(p su)仪仪大功率大功率超声波破碎超声波破碎(p su)(p su)仪仪第二十六页，共九十五页。4 4、化学、化学(huxu)(huxu)渗透法渗透法作用机理作用机理：某些某些有机溶剂，抗生素，表有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合

17、剂，变性剂面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫方法叫渗透法渗透法。问题问题：EDTAEDTA、甲苯、甲苯(ji bn)(ji bn)、Triton X-100Triton X-100、盐酸胍和脲的作用机理？盐酸胍和脲的作用机理？P70P70第二十七页，共九十五页。EDTAEDTA：破坏细胞的外层膜：破坏细胞的外层膜甲苯甲苯：溶解细胞膜的磷脂：溶解细胞膜的磷脂(ln zh)(ln zh)层层Triton X-100Triton X-100：溶解

18、内膜的双磷脂层：溶解内膜的双磷脂层盐酸胍和脲盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液作用，使疏水性化合物溶于水溶液第二十八页，共九十五页。优点（相对机械破碎）优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整细胞保持完整(wnzhng)，碎片少，利于进一步提取；，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷缺陷：时间长，效率低；时间长，效率低；化学试剂有毒；化学试剂有毒；通用性差通用性差第二十九页，共九十五页。5 5、酶溶法、酶溶法机理机理：利用利用(ly

19、ng)(lyng)生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)、-1,3-1,3-葡聚糖葡聚糖酶酶(glucanase)(glucanase)、-1-1，6-6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶（protease)protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、肽链内切酶、肽链内切酶（endopeptidase)endopeptidase)、壳多糖酶、壳多糖酶(chitinase)(chitinase)、细胞壁、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。溶解酶（几种酶的复合

20、物）等。第三十页，共九十五页。优点优点：一定的选择性；一定的选择性；细胞细胞(xbo)(xbo)外形完整，核酸释放少，有利于外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程进一步分离过程 缺点缺点：（只能用于实验室（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；溶酶价格高；通用性差，通用性差，不易确定最佳条件；不易确定最佳条件；第三十一页，共九十五页。6 6、微波、微波(wib)(wib)加热法加热法机理机理：微波加热导致细胞内极性微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，物质，尤其是水分子吸收微波能，产生产生(chnshng)(chnshng)大量热量，使胞内温

21、大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生度迅速上升，液态水汽化产生(chnshng)(chnshng)的压力将细胞膜和细胞壁的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。细胞收缩，表面出现裂纹。第三十二页，共九十五页。优点优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：缺陷：一般只适合一般只适合(shh)(shh)对热稳定物质的分离；对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和

22、树胶等的天然植物不适于富含淀粉和树胶等的天然植物第三十三页，共九十五页。机械机械(jxi)(jxi)破碎法与非机械破碎法与非机械(jxi)(jxi)破碎法的比较破碎法的比较比较项目比较项目机械法机械法非机械法非机械法破碎机理破碎机理切碎细胞切碎细胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小碎片细小碎片细小细胞碎片较大细胞碎片较大内含物释放内含物释放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）时间，效率时间，效率时间短，效率高时间短，效率高时间长，效率低时间长，效率低设备设备需专用设备需专用设备不需专用设备不需专用设备通用性通用性强强差差经济经济成本低成本低成本高成本高

23、应用范围应用范围实验室，工业范围实验室，工业范围实验室范围实验室范围第三十四页，共九十五页。克隆克隆(k ln)(k ln)表达的产物表达的产物基因工程基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)细胞细胞蛋白质蛋白质没有活性，一级结构正确，立体构型错误没有活性，一级结构正确，立体构型错误(cuw)(cuw)，无生物学活性！，无生物学活性！包涵体包涵体第三节第三节 蛋白质复性蛋白质复性难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。第三十五页，共九十五页。病毒在增殖的过程中，病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成常使寄主细胞内形成(xngchng)(x

24、ngchng)一种蛋白质一种蛋白质性质的病变结构性质的病变结构包涵体包涵体SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies第三十六页，共九十五页。包含体形成原因包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）比较复杂，目前尚不完全清楚。）缺少某些协助因子缺少某些协助因子（分子伴侣？）（分子伴侣？）或者由或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以于周围物理环境（温度等）不适，使其难以(nny)连续进行次级键的形成，中间产物相互连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。凝集而积累形成包含体。

25、应该考虑的事应该考虑的事：设法减少包含体的形成！设法减少包含体的形成！第三十七页，共九十五页。减少减少(jinsho)(jinsho)包涵体形成的策略包涵体形成的策略1、降低重组菌的生长温度降低重组菌的生长温度 降低培养温度降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度温度降低了无活性聚集体形成的速率降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。作用，从而可减少包涵体的形成。第三十八页，共九十五页。培养培养E.coliE.coli时添加时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止

26、分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长些添加剂不会影响细胞的生长(shngzhng)(shngzhng)、蛋白质的合成或运、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长(shngzhng)(shngzhng)添加剂还添加剂还有有乙醇乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基巯基或二硫化合物或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和形成）和NaClNaCl。3 3、供给供给(

27、gngj)(gngj)丰富的培养基，创造最佳培养条件丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、如供氧、pHpH等。等。2 2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达添加可促进重组蛋白质可溶性表达(biod)(biod)的生长添加剂的生长添加剂 第三十九页，共九十五页。蛋白质的复性蛋白质的复性(f xn)：包含体蛋白质包含体蛋白质溶溶解于解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动

28、折叠成具有活性的正确构型，这以自动折叠成具有活性的正确构型，这一一折叠过程折叠过程称为称为蛋白质复性蛋白质复性。如何如何(rh)(rh)使包涵体的构型复原成正确状态？使包涵体的构型复原成正确状态？第四十页，共九十五页。包含包含(bohn)(bohn)体的分离及溶体的分离及溶解解 分离包含体：分离包含体：对培养收集的细胞进行对培养收集的细胞进行破碎破碎 (高高压匀浆结合溶菌酶处理压匀浆结合溶菌酶处理)，然后，然后离心离心(500020000g/r)500020000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。性蛋白分离。洗涤：洗涤：除去除去包涵体沉淀的包涵体沉

29、淀的脂类和膜蛋白，脂类和膜蛋白，一般一般加加去污剂去污剂（Triton X-100Triton X-100或脱氧胆酸钠）和或脱氧胆酸钠）和低浓低浓度变性剂度变性剂（2mol/L2mol/L尿素或盐酸胍等）。尿素或盐酸胍等）。以避免以避免包包涵体溶解和复性的过程涵体溶解和复性的过程(guchng)(guchng)中中重组蛋白质的降解。重组蛋白质的降解。第四十一页，共九十五页。溶解：溶解：a.a.包涵体的溶解必须用包涵体的溶解必须用很强的很强的变性剂变性剂，通过离子，通过离子(lz)(lz)间的相互作用间的相互作用破坏包涵体蛋白间的破坏包涵体蛋白间的氢键氢键而增而增溶蛋白。以溶蛋白。以异氰盐酸胍异

30、氰盐酸胍的增溶效果最强，尿素稍的增溶效果最强，尿素稍差；差；b.b.去污剂去污剂（如（如SDSSDS）可以破坏蛋白内的）可以破坏蛋白内的疏水键疏水键，可，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中不允许用在制药行业中；c.c.酸酸（如（如70%70%甲酸）可以破坏蛋白的甲酸）可以破坏蛋白的次级键次级键从而增从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。第四十二页，共九十五页。d.d.对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入入还原剂还原剂（如（如DTTDTT、GSHGSH

31、、-ME-ME）打开）打开(d ki)(d ki)蛋蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。杂蛋白会影响包涵体的溶解。e.e.同时还应加入同时还应加入金属螯合剂金属螯合剂，如，如EDTAEDTA或或EGTAEGTA，用来螯合，用来螯合CuCu2+2+、FeFe3+3+等金属离子以防止等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。其与还原状态的巯基发生氧化反应。第四十三页，共九十五页。蛋白质的折叠蛋白质的折叠(zhdi)(zhdi)机理机理 目前有多种不同

32、的假设，但很多学目前有多种不同的假设，但很多学者者(xuzh)(xuzh)认为有一个认为有一个“熔球态熔球态”的的中中间状态间状态，在，在“熔球态熔球态”中，蛋白质中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。整就可形成正确的立体结构。第四十四页，共九十五页。蛋白质的具体步骤可用下式描述：蛋白质的具体步骤可用下式描述：伸展伸展(shnzhn)(shnzhn)态态中间体中间体后期中间体后期中间体天然态体天然态体聚集体聚集体第四十五页，共九十五页。核糖核酸核糖核酸(h tn h sun)(

33、h tn h sun)酶的变性和复性示意图酶的变性和复性示意图(A)(A)天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶(B)(B)变性失活变性失活(C)“(C)“错乱错乱”核糖核酸酶核糖核酸酶第四十六页，共九十五页。错误发生的机制错误发生的机制复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，分子分子(fnz)(fnz)间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、环境的影响，如温度、pHpH值、离子强度、复性值、离子强度、复性时间等因素的影响。时间等因素的影

34、响。第四十七页，共九十五页。不同条件下具体不同条件下具体(jt)(jt)复性方式复性方式1 1、透析、稀释和超滤复性法透析、稀释和超滤复性法：最传统、应用最：最传统、应用最普遍，原理普遍，原理-使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度的浓度。缺点：缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。稀稀释法释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大且处理量太大，不利于工业放大 ；透析法透析法耗时长，耗时长，易形成易形成(xngchng)(xngchng)无活性蛋

35、白质聚集体；无活性蛋白质聚集体；超滤法超滤法在膜上在膜上聚集变性，易造成膜污染。聚集变性，易造成膜污染。第四十八页，共九十五页。2 2、高蛋白浓度下的复性方法：、高蛋白浓度下的复性方法：（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。较高的复性率。）缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够段之间有足够(zgu)(zgu)的时间进行折叠复性。因的时间进行折叠复性。因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋为

36、完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。白一起聚集。第四十九页，共九十五页。温度跳跃策略温度跳跃策略(cl)(cl)：变性蛋白在变性蛋白在低温低温下复性折下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为中间体大都转化为不易聚集的不易聚集的后期中间体后后期中间体后，温度快速升高温度快速升高来促进来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。复性在中等的变性剂浓度下进行复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓，变性剂浓度应度应高到高到足以有效防止聚集，同时又必须足以有效防止聚集，同时又必须低到低到能够能够(nnggu)(nnggu)

37、引发正确复性。引发正确复性。第五十页，共九十五页。3 3、添加促进剂的复性方法添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以进作用可以(ky)(ky)分为：分为：稳定正确稳定正确折叠蛋折叠蛋白质的天然结构、白质的天然结构、改变错误改变错误折叠蛋白质折叠蛋白质的稳定性、的稳定性、增加增加折叠复性折叠复性中间体中间体的溶解的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性性、增加非折叠蛋白质的溶解性。第五十一页，共九十五页。常用常用(chn yn)(chn yn)促进剂促进剂：a、共溶剂共溶剂：如通过与中间体特异的形成非聚集复合物，阻止蛋白质如通过与中间体特异的形成非

38、聚集复合物，阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂去污剂及表面活性剂：如如Trition X-100Trition X-100、CHAPsCHAPs、磷脂、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；难去除；c、氧化氧化-还原剂还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫体系，通过促进不正确形成的二硫键快速交换反

39、应，提高了正确配对的二硫键的产率；键的产率；d、小分子的添加剂小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集。止蛋白聚集。e、0.40.6M L-Arg：L-ArgL-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。地提高包涵体蛋白质的折叠效率。9 9第五十二页，共九十五页。f、添加分子添加分子(fnz)(fnz)伴侣和折叠酶伴侣和折叠酶g、人工伴侣人工伴侣

40、h、单克隆抗体单克隆抗体I、其它其它：多聚离子化合物、甘油等。多聚离子化合物、甘油等。此外此外(cwi)(cwi)，有：，有：第五十三页，共九十五页。4、液相色谱（液相色谱（LCLC）复性法：）复性法：疏水相互作用色谱（疏水相互作用色谱（HICHIC）、离子交换色谱）、离子交换色谱（IECIEC）、凝胶排阻色谱（）、凝胶排阻色谱（SECSEC）、亲和色谱（）、亲和色谱（AFCAFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。其中）已成功的对变性蛋白进行了复性。其中HICHIC的分离效果较理想的分离效果较理想(lxing)(lxing)；SECSEC最差；最差；盐酸胍盐酸胍会在会在IECIEC柱上保留，与蛋

41、白一起洗脱下来；柱上保留，与蛋白一起洗脱下来；AFCAFC使使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，用范围窄、所需时间长、价格昂贵，。第五十四页，共九十五页。变性蛋白在变性蛋白在HICHIC上的复性机理上的复性机理：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入(jnr)(jnr)HICHIC系统后，系统后，变性剂在柱上的作用力较弱，变性蛋白质的作用变性剂在柱上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱。随着流动相的不断变化，动相一起流出色谱柱。随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行

42、变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附吸附-解解吸附吸附-再吸附再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱柱。第五十五页，共九十五页。液相色谱复性的优点：液相色谱复性的优点：（与传统的稀释法和透析法相比）与传统的稀释法和透析法相比）在进样后在进样后可很快除去变性剂可很快除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而分子聚集，从而避免了沉淀

43、的产生避免了沉淀的产生(chnshng)(chnshng)，提高，提高蛋白质复性的质量和活性回收率蛋白质复性的质量和活性回收率；在蛋白质复性同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离在蛋白质复性同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本便于回收变性剂，降低废水处理成本。第五十六页，共九十五页。5、反胶束复性法反胶束复性法：表面表面(biomin)(biomin)活性剂的极活性剂的极 性头朝内，疏水性头朝内，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 间形成极性的间形成极性的“核核”有机溶剂有机溶剂极性极性“头头”极性

44、的极性的“核核”非极性非极性“尾尾”蛋白质在反胶束内水相中可以保蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，这样可使蛋白持其构象和活性，这样可使蛋白质相互分离质相互分离(fnl)(fnl)，减少了蛋白质，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用。折叠过程中的聚集作用。第五十七页，共九十五页。第四节第四节 固液分离固液分离(fnl)(fnl)分离分离(fnl)(fnl)细胞、细胞碎片、包含体、细胞、细胞碎片、包含体、沉淀物等的手段，沉淀物等的手段，不仅应用于初级阶不仅应用于初级阶段，而且也应用于精制阶段段，而且也应用于精制阶段。第五十八页，共九十五页。一、离心一、离心(lxn)(lxn)沉沉降降根据固体

45、和液体之间的根据固体和液体之间的密度差密度差,利用离心机利用离心机提供的离心力实现固液分离。提供的离心力实现固液分离。优点：技术易掌握；结果重复性好优点：技术易掌握；结果重复性好沉降的难易取决于固体物质和液体的密度沉降的难易取决于固体物质和液体的密度差差,同时还取决于固体和液体的其他性质以同时还取决于固体和液体的其他性质以及离心机的离心能力及离心机的离心能力.(.(可以可以(ky)(ky)颗粒颗粒沉降速沉降速度表示度表示)第五十九页，共九十五页。斯托克斯公式斯托克斯公式(Stokes):(Stokes):Uc=d Uc=d2 2(s s-L L)r)r2 2/18/18UcUc颗粒颗粒(kl)

46、(kl)沉降速度沉降速度;dd颗粒直径颗粒直径(假定为球形假定为球形)ss固体密度固体密度LL液体密度液体密度rr离心半径离心半径;角速度角速度;(r(r2 2:离心力离心力)液体粘度液体粘度第六十页，共九十五页。分离因数分离因数(ynsh)(ynsh):a=(r:a=(r2 2:离心力离心力)/g)/gaa衡量离心力的大小主要指标衡量离心力的大小主要指标,应应该主要是增大角速度而不是直径。该主要是增大角速度而不是直径。提高离心效果可通过增加转速和延长提高离心效果可通过增加转速和延长时间来取得。时间来取得。(r(r2 2:离心力离心力):):固液分离固液分离(fnl)(fnl)最重要的影响因素

47、最重要的影响因素第六十一页，共九十五页。转筒常规转筒常规(chnggu)(chnggu)工业用离心机工业用离心机（-张家港华大离心机公司）张家港华大离心机公司）SSCSSC型离心机为三足式上部人工型离心机为三足式上部人工卸料沉降离心机，该系列离心卸料沉降离心机，该系列离心机装鼓壁上无孔，属沉降型转机装鼓壁上无孔，属沉降型转鼓，操作维修方便。主要适用鼓，操作维修方便。主要适用于于固相颗粒细小，悬浮液粘性固相颗粒细小，悬浮液粘性较大，过滤较大，过滤(gul)(gul)介质再生困介质再生困难，且含量较少的悬浮液的固难，且含量较少的悬浮液的固液分离。液分离。第六十二页，共九十五页。管式工业用离心机管式

48、工业用离心机（-张家港华大离心机公司张家港华大离心机公司(n s)(n s)）悬浮液从进料管进入转鼓，固相悬浮液从进料管进入转鼓，固相颗粒在离心力场作用下受到离心颗粒在离心力场作用下受到离心力的加速沉降至转鼓内壁，沉降力的加速沉降至转鼓内壁，沉降的颗粒在螺旋输送器叶片的推动的颗粒在螺旋输送器叶片的推动下，从（直筒段）沉降区通过下，从（直筒段）沉降区通过（锥段）干燥区至固相出口排出；（锥段）干燥区至固相出口排出；经澄清的液相从溢流孔溢出。从经澄清的液相从溢流孔溢出。从而实现而实现(shxin)(shxin)固、液相自动、连固、液相自动、连续的分离。续的分离。可应用于脱水、浓缩、分级澄可应用于脱水

49、、浓缩、分级澄清等不同场合。清等不同场合。第六十三页，共九十五页。第六十四页，共九十五页。刮刀刮刀(u do)(u do)卸料工业用离心机卸料工业用离心机（-张家港华大离心机公司）张家港华大离心机公司）主电机主电机(dinj)(dinj)带动套装的内外转鼓带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转鼓，全速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相

50、物截留在装置抽走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达到内转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一步分离，预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋排出机外，然后自动洗网，料螺旋排出机外，然后自动洗网，开始下一个循环。开始下一个循环。第六十五页，共九十五页。二、微孔二、微孔(wi kn)(wi kn)膜过滤膜过滤根据根据流体各组分尺寸流体各组分尺寸(ch cun)(ch cun)大小的不同大小的不同，利用利用高分子聚合膜，过滤分离高分子聚合膜，过滤分离