基因工程基本原理及技术.pptx

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1、基因工程基因工程 基本原理基本原理及技术及技术基因克隆基因克隆(genecloning)：是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因的无细胞扩增-PCR）的技术。基因表达基因表达(geneexpression)：是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。基因工程（基因工程（geneengineering）或称重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）：是指将获取的目的基因片段在体外与载体DNA通过人工剪切、编接构成DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和表达，这种有目的的应用分子

2、克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程.基因工程基本步骤目的DNA制备；载体DNA选择DNA体外重组技术（DNA酶切实验、连接实验）重组DNA的转化（转染）试验重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，（重组体的表型筛选，指纹图谱法，PCR方法，探针杂交法）目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法遗传互补法，免疫化学法Western印杂交法，微细胞法微细胞法(microcellmethod)图l基因工程操作流程一.基因克隆(一)“工程原料工程原料”的获取的获取-获取目的基因获取目的基因基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、

3、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。获取目的基因有三个途径：1.从生物基因组中分离纯化（鸟枪法shotgun）：原核细胞DNA遗传背景不清。组建基因文库检测鉴定。2.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。用于结构清楚、分子量较小的基因3.酶促合成法-反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因.mRNA逆转录cDNA做目的基因。可PCR法合成。Principle of PCRDNA polymerase use single strand DNA as temp

4、late to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buffer;Mg2+,Primers)Chain reaction:Repeated cycles of reaction under the same condition.The PCR reactionAnnealPrimers45-68CtemplatePrimers,dNTPs,Taqpolymerase,Mg2+ExtendPrimers72CDenature95CWhat do we achieve by cycling temperature in the presence primers,dN

5、TP,Taq polymerase?Round1AnnealprimersExtendprimersThe exponential amplification of the gene in PCRThe first 4 cycles of a PCR reaction in detail.In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle,8 double strands

6、 of the right length are copied.Optimum condition of PCRCorrectsourcesoftemplateDNABesttemperatureselectinthreestepsAppropriateprimersinbothendOthers:Mg2+;Inhibitoretal.Primer Design Is Vital1.Primers should usually be 18-25 bases long2.Need as much sequence information as possible outside target3.3

7、 end of primer is most important:best to have G or C at end4.Primers should have approximately equal melting temperatures5.Avoid repetitive sequence(internal hairpin structures)6.Aim for 40-60%G+C content7.Avoid complementarities within or between primers8.Can modify 5 ends to add restriction sites

8、etcTA Cloning Of PCR Products Requires“A”sAAPCRproductpGEM-TpCR2.1-TOPOTaq-yesPfu-noTypical Reaction Mixture25 or 50l in a micro Eppendorf(0.5ml)tubeCOMPONENTVOLUMEFinalConcentration10PCRbuffer5l110dNTPs(2mM)5l200MForwardprimer(10pmols/l)5l1M(50pmols/50l)Reverseprimer(10pmols/l)5l1M(50pmols/50l)Geno

9、micDNAtemplate2l1gThermostablepolymerase(2U/l)0.5l1unitH2O(to50lFinalvolume)27.5lThe Perfect ResultReliable PCR form every Sample(二)、载体载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。载体应具备下列条件：(1)有复制起点，能自我复制；(2)具有高效调控表达系统；(3)对某一种限制酶只有一个切点；(4)必须有一种选择性遗传标记；(5)携带外源基因的幅度宽；(6)分子量小，拷贝数多.载体的种类按来源分：质粒载体(p

10、lasmidvector)原核、噬菌体载体(phagevector)原核、柯氏质粒载体(cosmidvector)真核、病毒载体(virusvector)真核.按作用分：克隆载体(cloningvector)、表达载体(expressionvector)、穿梭载体(shuttlevector)1.质粒载体质粒载体:(1)分子量较小,在细菌中有较多的拷贝数。(2)松驰型:质粒复制与染色体不同步和蛋白质合成功能无关。(3)具有一个以上的标志，便于筛选。(4)具有数个或一个单一的酶切点。天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322，pUC19。Ampr

11、LacZoriop2.噬菌体载体噬菌体载体野生型噬菌体(Wildtypephage，wt)DNA长度约为48.5kb(分子量3.2107)，在病毒颗粒中为双链线形分子，具具有有12bp的的粘粘性性末末端端(cohesiveend)，进入大肠杆菌之后立即互补成环。入噬菌体作为克隆载体有两个优点：两个优点：1)转转染染效效率率高高:可在体外包装，产生有感染性的噬菌体颗粒，每个颗粒都可能感染一个大肠杆菌.2)筛选程序简便筛选程序简便:一定长度的噬菌体才能包装.现现改建的载体类型有：插入型载体如gt11;替换型载体EMBL3、EMBL4。3.柯氏质粒或称粘尾质粒柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid)是指

12、含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNAcos区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid的构造特点:(1)含有抗药标志和复制起始部位。(2)一个或多个单一酶的限制位点(3)带有入噬菌体粘性末端。(4)分子小，约46kb，可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。如cosmidpHC794病毒载体常用的动物病毒表达载体可分为两大类：整合型（integrated）载体即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整

13、合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。5克隆载体克隆载体(cloningvector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。常用载体pUC18pUC19.6表表达达载载体体(expr

14、essionvector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译。7穿梭载体穿梭载体(shuttlevector)又称双功能载体(bifunctionalvector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体.其可同时具有细细菌菌质质粒粒的的复复制制原原点点和真真核核生生物物可可识识别别的的病病毒毒复复制制原原点点或或酵酵母母菌菌的的自自主主复复制制序序列列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，

15、再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。如pKSV一10、pJDB219载体等。oriPoLacZkmram2（三）（三）.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行DNA分子切割的特殊工具。因此它有分子切割的特殊工具。因此它有“分子分子剪刀剪刀”或或“分子手术刀分子手术刀”之称。之称。1、概念：限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)是指能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。2、识别序列的特点(1)专一；(2)常由46个碱基组成；(3)具有回文序列(palindromi

16、csequence)切口类型：(1)形成粘末端(cohesiveend)：DNA分子末端的单链片段能与其他DNA单链片段互补配对形成双链者，这两个DNA分子末端单链片段即为粘末端：如BamH5-GGATCC-33-CCTAGG-55-NNNNNN-GGATCC-NNN-33NNNNNN-CCTAGG-NNN-5（2）形成平末端；SmaCCCGGGGGGCCC4、酶切反应条件：（1）需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘待度增加从而抑制酶分子的扩散导

17、致 酶 切 反 应 不 彻 底。常 为 50ul内 含 1ugDNA）（2）合适的酶量：酶和底物比例210u/ugDNA,避免使用过高的酶浓度（3）合适的反应介质（缓冲体系）：反应均以Tris-Hcl作缓冲液；PH值多在7.48.0之间；反应需要Mg2+激活；多数酶反应尚需要2巯基乙醇（BME）或二硫基苏糖醇（DTT）的存在。此外，许多酶反应还需要NaCl，但不同的酶对NaCl的需要量各有差别。（4）温度和作用时间等：大多数限制酶的反应温度为370C，个别酶则需要500C、600C或650C的高温。一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。(四四)DNA重组重组

18、(连接连接)和基因转移和基因转移1、DNA重组重组（DNArecombination）不同的DNA片段之间的连接需要另一种工具酶-连接酶连接酶的帮助.目的DNA酶切片断载体DNA酶切片断T4DNAligaseDNA重组体.T4DN连接酶(T4DNligase):是从感染T4噬菌体的Ecoli中分离得到的一种连接酶，其催化两个DNA片段的3一0H与5一P末端形成磷酸二酯键。（1）粘末端连接）粘末端连接(cohesiveendligate)：（a）目目的的基基因因和和载载体体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基团，使5端带一OH)处理载体，可防止载体自身环

19、化。（b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。(2)平平末末端端连连接接(bluntendligate)：目目的的基基因因和和载载体体用用同同一一种种能能产产生生平平末末端端的的酶酶切切割割后后连连接接，重重组组后后保保留留原原来来的的酶酶切切位位点点，如如SmalCCC GGG所用酶量要大所用酶量要大.连接反应条件连接反应条件连连接接酶酶的的活活性性;DNA的的纯纯度度,载载体体与与目目的的基基因因的的比比例例;PH值值7.2-7.8适适宜宜;镁镁离离子子、DTT(二二硫硫基基苏苏糖糖醇醇,有有促促进进连连接接作作用用);ATP；;14(不

20、高于不高于16)过夜。过夜。2、基基因因转转移移（genetransfer）把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的转化或转染的方法。(1)受体细胞受体细胞：大肠杆菌E.coli（EK系统）；优点优点:细菌细胞作为表达系统的优点是优点是：操作简单、增代时间短、价格低廉。某些蛋白质的表达水平很高缺点缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠,蛋白质常无生物活性。异体蛋白质，常对细菌有毒性作用.缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如在蛋白质上加上磷酸根(phosphate)和糖基.枯草杆菌；酵母菌细胞；哺乳动物细胞；昆虫细胞。受体细胞应具备的主要条件是受体细胞应具备

21、的主要条件是R-M-(限制酶和修饰酶缺陷)。受体菌处于感受态(2)转化转化(transformation)：以质粒DNA为载体构成的DNA重组体转入受体细胞的方式称转化。制备感感受受态态细细胞胞（competentcell）：取对数生长期菌细胞，用CaCl2(冰冷)处理，使其易于接受外源DNA。感受态菌与重组DNA混合放冰浴40分钟；42热休克2分钟；(如用AP平板培养基筛选，需37培养1小时)；涂到含有抗生素的平校培养基上，37培养过夜。(3)转染转染(trasfection)以以噬噬菌菌体体或或病病毒毒为为载载体体构构建建的的DNA重重组组体导入受体细胞的方式称转染体导入受体细胞的方式称转

22、染。选用受体细胞不同，转染方式不同。若以大肠杆菌为受体菌转染重组噬菌体DNA时，需要用噬菌体的包装蛋白进行体外包装，形成有感染性的噬菌体颗粒，才能感染大肠杆菌受体细胞。以哺乳动物细胞做受体细胞时用磷酸钙转染技术和电穿孔（electroportion）转染技术直接转染重组体DNA。（五）克隆株的筛选与鉴定（五）克隆株的筛选与鉴定1.根据重组体的表型筛选根据重组体的表型筛选抗性基因插入失活（负性选择法）抗性基因插入失活（负性选择法）pBR322；显色平板筛选法：如显色平板筛选法：如pUC19做载体做载体(-互补）互补）.LacZ-受体菌编码受体菌编码-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）片断

23、端）片断pUC载体编码载体编码-半乳糖苷酶氨基端（半乳糖苷酶氨基端（N端）的端）的肽肽转化菌株转化菌株含含APr,X-gal和和IPTG培养基培养基菌落颜色菌落颜色pUC19rDNAZ基因失活、不表达基因失活、不表达一半一半无色无色(白颜色白颜色)乳糖苷酶、乳糖苷酶、Xgal不被分解不被分解pUC19DNAZ基因表达基因表达一半乳糖苷酶一半乳糖苷酶蓝色蓝色(自身环化）自身环化）LacZopAPr2.2.检测目的基因检测目的基因（1 1）质粒）质粒DNADNA图谱或指纹图谱法图谱或指纹图谱法(fingerprint(fingerprint）提取质粒DNA直接电泳或用相应的内切酶消化后电泳，根据电

24、泳带的数目、分子量大小分析确定。(2)PCR (2)PCR方法：方法：提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。（3 3）核酸杂交法）核酸杂交法(nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)：用已知的特异DNA探针（probe）与变性重组质粒DNA杂交。fig2.P1.fingerpringtmapofrecombinationplasmid1.MolecularStandard(SPP1DNA/EcoR1)2.pUC19 plasmid DNA digestedwithSalIandEc

25、oR13.pUC19plasmidDNA4.Recombination plasmid DNAdigestedwithSalIandEcoR15.RecombinationplasmidDNA3.目的基因表达产物的筛选与鉴定目的基因表达产物的筛选与鉴定表型筛选法表型筛选法当外援基因携带遗传标记转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失标记表形。遗传互补法遗传互补法使用受体菌是营养缺陷型,培养基是基础培养基,当目的基因在受体菌内表达时,受体菌的营养缺陷被纠正,因而在基础培养基上能生长.免疫化学法免疫化学法该方法是用已知的抗体检查克隆菌株目的基因表达的蛋白抗原。如Westernblot印迹杂交法：提取克隆菌株菌体蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转印NC膜特异抗体酶标抗抗体酶底物观察特异显色带。噬菌斑形成筛选法噬菌斑形成筛选法当噬菌体载体包装外援重组DNA即可形成活性噬菌体克力在培养板上形成噬斑，借此可以初筛。利用报告基因筛选转化细胞利用报告基因筛选转化细胞 用融合基因顺时表达系统将报告基因置于顺式调控因子下游，据报告基因活性衡量顺式调控因子的转录能力