实验三离心技术及酶学实验精品文稿.ppt
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1、实验三离心技术及酶学实验第1页,本讲稿共38页v概念概念 生物样品悬浮液在高速旋转下,由于巨大生物样品悬浮液在高速旋转下,由于巨大的离心力作用,使悬浮的微小颗粒的离心力作用,使悬浮的微小颗粒(细胞器、细胞器、生物大分子的沉淀等生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,从以一定的速度沉降,从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度,离心技术主要用于颗粒的质量、大小和密度,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。于各种生物样品的分离和制备。第2页,本讲稿共38页第一节 基本原理v离心力离心力 当一个粒子当一个粒子(生物大分子或细胞器生物
2、大分子或细胞器)在高速在高速旋转下受到离心力作用时,此离心力旋转下受到离心力作用时,此离心力“F”F”由下式定义,即:由下式定义,即:第3页,本讲稿共38页v相对离心力(相对离心力(RCF)通常离心力常用地球的引力的倍数来表通常离心力常用地球的引力的倍数来表示,所以称为相对离心力。示,所以称为相对离心力。在离心场中,作用于颗粒的离心力相当在离心场中,作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数,单位是重力加速度于地球重力的倍数,单位是重力加速度g(980cm/s2)。)。第4页,本讲稿共38页v RCF=1.11910-5(rpm)2rv(rpm-revolutions per minute为每分钟
3、转数,r/min)v低速离心时常以转速低速离心时常以转速“rpm”来表示来表示v高速离心时则以高速离心时则以“g”表示表示第5页,本讲稿共38页第二节 离心机的主要构造和类型 工业用离心机工业用离心机离心机离心机 制备性离心机制备性离心机 实验用离心机实验用离心机 分析性离心机分析性离心机 第6页,本讲稿共38页v一、制备性离心机的三类一、制备性离心机的三类1 1 普通离心机:最大转速普通离心机:最大转速6000rpm6000rpm左右左右2 2 高速冷冻离心机:最大转速为高速冷冻离心机:最大转速为2000020000 25000rpm25000rpm(r/minr/min)3 3超速离心机:
4、转速可达超速离心机:转速可达500005000080000rpm80000rpm,超速离心机装有真空系统,这是它与高速离超速离心机装有真空系统,这是它与高速离 心机的主要区别。心机的主要区别。第7页,本讲稿共38页二、转头v1 1角式转头角式转头 第8页,本讲稿共38页v2 2荡平式转头:荡平式转头:这种转头是由吊着的这种转头是由吊着的4 4或或6 6个自由活动个自由活动 的吊桶的吊桶(离心套管离心套管)构成。构成。v3 3区带转头:区带转头:区带转头无离心管,主要由一个转子区带转头无离心管,主要由一个转子 桶和可旋开的顶盖组成。桶和可旋开的顶盖组成。v4 4 垂直转头:垂直转头:其离心管是垂
5、直放置的。其离心管是垂直放置的。v5 5 连续流动转头:连续流动转头:转头与区带转头类似,由转子桶和有入口和出口转头与区带转头类似,由转子桶和有入口和出口 的转头盖及附属装置组成。的转头盖及附属装置组成。第9页,本讲稿共38页三、离心管 v塑料离心管常用材料有聚乙烯塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)(PE),聚碳酸,聚碳酸酯酯(PC)(PC),聚丙烯,聚丙烯(PP)(PP)等,其中等,其中PPPP管性能较好。管性能较好。塑料离心管的优点是透明塑料离心管的优点是透明(或半透明或半透明),硬度,硬度小,可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形,小,可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形,抗有机溶剂腐蚀性差,使用
6、寿命短。抗有机溶剂腐蚀性差,使用寿命短。第10页,本讲稿共38页v不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品,如强酸、强碱等。的化学药品,如强酸、强碱等。v离心管盖离心管盖离心前必须盖严,配平时需带管盖重量离心前必须盖严,配平时需带管盖重量防止样品外泄、挥发防止样品外泄、挥发支持离心管,防止离心管变形支持离心管,防止离心管变形第11页,本讲稿共38页v制备性超速离心的分离方法制备性超速离心的分离方法v差速沉降离心法差速沉降离心法 逐渐增加离心速度,或者低速、高速交替进逐渐增加
7、离心速度,或者低速、高速交替进行离心,使不同的离心速度及不同离心时间行离心,使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。下分批分离的方法。用途:分离沉降系数相差较大的颗粒用途:分离沉降系数相差较大的颗粒优点:操作简便优点:操作简便缺点:分理效果差,颗粒受挤压易变性失活缺点:分理效果差,颗粒受挤压易变性失活第12页,本讲稿共38页v密度梯度区带离心法(区带离心法)密度梯度区带离心法(区带离心法)定义:将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉定义:将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带配到梯
8、度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。的分离方法。优点:分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤优点:分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤压变形保持活性压变形保持活性缺点:离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、缺点:离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、操作严格不易掌握操作严格不易掌握第13页,本讲稿共38页五、离心操作的注意事项v使用各种离心机时,使用各种离心机时,必须事先在天平上精密地必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物平衡离心管和其内容物,转头中绝对不能装载,转头中绝对不能装载单数的管子,当转头只是部分装载时,单数的管子,当转头只是部分装载时,管子必管子必须互相对称地放在转头中须互相对称
9、地放在转头中,以便使负载均匀地,以便使负载均匀地分布在转头的周围。分布在转头的周围。v每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限,每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限,使用转头时要查阅说明书,不得过速使用。使用转头时要查阅说明书,不得过速使用。第14页,本讲稿共38页v装载溶液时,要根据各种离心机的具体操作说明进行,根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管,有的离心管无盖,液体不得装得过多,以防离心时甩出,造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管,则常常要求必须将液体装满,以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。v若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心
10、机的转头室内预冷。v离心过程中不得随意离开第15页,本讲稿共38页实验内容实验内容v酶的提取及比活性测定酶的提取及比活性测定第16页,本讲稿共38页一、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的分离纯化及比活性测定 目的 1掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注意事项 2了解检测AKP活性测定的原理和方法。第17页,本讲稿共38页v方法方法酶的本质:蛋白质酶的本质:蛋白质v盐析法盐析法v有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法v层析法层析法v电泳电泳第18页,本讲稿共38页酶酶组织细胞:先破碎细胞,再用一定的试剂提取体液:直接提取方法物理方法化学方法第19页,本讲稿共38页v原则原
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