电子课件第四章 合成生物学的基础研究.ppt

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2、学院生命学院 合成生物学概述合成生物学概述 合成生物系统的设计合成生物系统的设计 合成生物系统的数学模拟与性能分析合成生物系统的数学模拟与性能分析 合成生物学的基础合成生物学的基础 合成生物学的应用研究合成生物学的应用研究 最新案例与讨论最新案例与讨论提纲提纲合成生物学的基础合成生物学的基础基础提要:乳糖操纵子模型，基因表达与调控，分子病毒学第一部分：模拟逻辑功能的基础研究第一部分：模拟逻辑功能的基础研究逻辑门功能线路逻辑门功能线路基因调控开关基因调控开关RepressilatorRepressilator细胞群体系统脉冲发生器细胞群体系统脉冲发生器逻辑门功能线路逻辑门功能线路逻辑门逻辑门（“

3、与与”“”“或或”“”“非非”）数字电子线路的数字电子线路的基本内容基本内容，现代高精尖数字仪器的，现代高精尖数字仪器的基本部件基本部件，也是最基本的也是最基本的运算单元运算单元。合成生物学的设计和研究的基础：模拟工程领域合成生物学的设计和研究的基础：模拟工程领域的逻辑门的功能的逻辑门的功能。逻辑门实现的元件遗传线路的实现遗传线路的实现工作原理工作原理：输入输入输出输出激活因子诱导物基因启动子操纵子RNAp基因启动子操纵子RNAp激活因子逻辑逻辑“与与”功能遗传线路功能遗传线路与与lacItetRgfpLacITetRIPTGaTc阻遏激活A记忆功能的记忆功能的“与与”门遗传线路门遗传线路CI

4、启动子1阻遏激活cI启动子2逻辑逻辑“或或”功能遗传线路功能遗传线路或或阻遏激活LacITetRaTcIPTG启动子1启动子2启动子3A小结小结 上述的逻辑门遗传线路均为转录水平，利上述的逻辑门遗传线路均为转录水平，利用诱导物和激活因子可成功的制作逻辑门中的用诱导物和激活因子可成功的制作逻辑门中的“与与”和和“或或”功能。功能。这是一种有效的构建生物模块的方法这是一种有效的构建生物模块的方法。基因调控开关基因调控开关基因开关：基因开关：某种化学诱导物存在或缺乏时，或某种化学诱导物存在或缺乏时，或者在两个独立的外界刺激作用下，基因处于两种者在两个独立的外界刺激作用下，基因处于两种可能状态中的一种

5、的系统。可能状态中的一种的系统。几种基因开关几种基因开关：转换开关；双相开关；转换开关；双相开关；RiboswitchRiboswitch；双稳态开关。；双稳态开关。转换开关转换开关 转换开关（转换开关（inverterinverter）：因其输出是输入的）：因其输出是输入的转换函数而得名，即输入为低时输出是高，反之转换函数而得名，即输入为低时输出是高，反之亦然。亦然。正控阻遏系统即可看做是天然的转换开关：正控阻遏系统即可看做是天然的转换开关：效应分子输出为高时，基因不表达，系统输出为效应分子输出为高时，基因不表达，系统输出为低；效应分子输出为低时，基因表达，系统输出低；效应分子输出为低时，基

6、因表达，系统输出为高。为高。合成生物学中的转换开关合成生物学中的转换开关转换开关的构建转换开关的构建 Directed evolution of a genetic circuit.PNAS.2002,99:16587-16591.Logical representation of the same circuit Directed evolution of a genetic circuit.PNAS.2002,99:16587-16591.双相开关双相开关什么是双向开关（双向开关（biphasic switchbiphasic switch）？噬菌体中通过一个双向操纵子OR来维持溶源状态，

7、这个操纵子由阻遏蛋白CI和反阻遏Cro（分别由cI基因和cro基因编码）结合到相邻的三个位点（OR1、OR2和OR3）来调控。CI蛋白对cro基因的转录起着负调控作用，对cI基因本身的转录则既有正调控又有负调控作用，既双向开关双向开关（biphasic switchbiphasic switch）作用机理作用机理cI基因和基因和cro基因编码基因编码噬菌体转录的主要调节蛋白噬菌体转录的主要调节蛋白CI和和Cro。作用机理作用机理-Prediction and measurement of an autoregulatory genetic module.PNAS.2003,100(13):77

8、14-7719应用举例应用举例-PNAS.2003,100(13):7714-7719Riboswitch Riboswitches are complex folded RNA domains that serve as receptors for specific metabolites.These domains are found in the non-coding portions of various mRNAs,where they control gene expression by harnessing allosteric structural changes that a

9、re brought about by metabolite binding.New findings indicate that riboswitches are robust genetic elements that are involved in regulating fundamental metabolic processes in many organisms.-Gene regulation by riboswithes.NRMCB,2004,5:451-463.Guanine(G)binding involves base pairing to a cytidine(C)re

10、sidue of the aptamer and causes formation of an intrinsic terminator stem that turns off gene expression.P1P3 represent pairing elements that are essential for formation of the aptamer.When G is absent,the anti-terminator stem is formed at the expense of P1.A uridine(U)residue is responsible for bas

11、e pairing to the ligand.Adenine(A)binding prevents formation of the terminator,thereby causing gene expression to switch on.In this case,the antiterminator structure is part of the aptamer(stems P1 and P2).In the absence of adenine,some sequences of P1 and P2 now form apart of the intrinsic terminat

12、or用于控制转录后基因调控的人工用于控制转录后基因调控的人工RiboswitchRiboswitch系统系统线性线性-环相互作用示意图环相互作用示意图程序化控制的真核基因表达的小Riboregulators双稳态开关双稳态开关 双稳态开关也称双稳态开关也称“拔动开关拔动开关”，可以通过，可以通过人为调节实现基因线路在两种不同稳定状态间人为调节实现基因线路在两种不同稳定状态间的切换。经典的转录水平双稳态开关由两个启的切换。经典的转录水平双稳态开关由两个启动子组成，每个启动子的动子组成，每个启动子的“开开”和和“关关”状态状态之间具有明显的界限，只有通过瞬间的诱导因之间具有明显的界限，只有通过瞬间

13、的诱导因素变化才能切换基因拨动开关至其中的一个稳素变化才能切换基因拨动开关至其中的一个稳态，且在移除其输入激励后仍会维持原来的状态，且在移除其输入激励后仍会维持原来的状态态。在大肠杆菌中构建双稳态开关在大肠杆菌中构建双稳态开关一一:基因线路设计基因线路设计：阻遏子阻遏子2阻遏子阻遏子1阻遏蛋白阻遏蛋白1阻遏蛋白阻遏蛋白2启动子启动子1启动子启动子2诱导物诱导物2诱导物诱导物1阻遏激活双稳态开关状态双稳态开关状态状态状态启动子启动子1启动子启动子2阻遏子阻遏子1阻遏子阻遏子2荧光蛋白荧光蛋白A开启关闭不表达表达无B关闭开启表达不表达有状态状态A状态状态B诱导物诱导物2诱导物诱导物1二二.基因线路

14、实现基因线路实现方案方案启动子启动子阻遏子阻遏子诱导物诱导物APtrc-2lac IIPTGBPl slconcIts温度CPl tetO1tetRaTc双稳态开关质粒结构双稳态开关质粒结构三三.数学模型的建立数学模型的建立 其中，其中，U,VU,V分别表示两种阻遏蛋白的量，分别表示两种阻遏蛋白的量，11，22为两种启动子在没有阻遏蛋白时的表达速为两种启动子在没有阻遏蛋白时的表达速率；率；-U,-V-U,-V表示两种阻遏蛋白的自然降解速率，表示两种阻遏蛋白的自然降解速率，而而，为启动子的抑制参数，数值越大表示阻为启动子的抑制参数，数值越大表示阻遏蛋白对启动子的抑制作用越大遏蛋白对启动子的抑制作

15、用越大。双稳态开关状态图双稳态开关状态图不同启动能力和抑制作用下双稳态开关示意图不同启动能力和抑制作用下双稳态开关示意图四四.功能检测功能检测pTAK117 switching timeRepressilator 振荡振荡 The repressilator is a synthetic genetic regulatory network reported in a paper1 by Michael Elowitz and Stanislas Leibler.This network was designed from scratch to exhibit a stable oscilla

16、tion which is reported via the expression of green fluorescent protein,and hence acts like an electrical oscillator system with fixed time periods.The network was implemented in Escherichia coli using standard molecular biology methods and observations were performed that verify that the engineered

17、colonies do indeed exhibit the desired oscillatory behavior1 A Synthetic Oscillatory Network of Transcriptional Regulators;Michael Elowitz and Stanislas Leibler;Nature.2000 Jan 20;403(6767):335-8.一一.遗传线路的设计遗传线路的设计 图中采用了三个启动子，每个启动子所控制图中采用了三个启动子，每个启动子所控制的基因的表达产物均能抑制下游最近邻一个启动的基因的表达产物均能抑制下游最近邻一个启动子的启动。子

18、的启动。Repressilator遗传线路图遗传线路图 tetR-litecI-litelacI-liteTetRCILacIPllacO1PrPltetO1PltetO1阻遏激活阻遏子调控模型质粒构建示意图阻遏子调控模型质粒构建示意图二二.数学模型的建立数学模型的建立 其中，其中，p pj j为三种阻遏蛋白的浓度；为三种阻遏蛋白的浓度；m mi i为它们对应的为它们对应的mRNAmRNA的浓度；的浓度；0 0为启动子的渗漏启动速率。为启动子的渗漏启动速率。+0 0 为为启动子的正常启动速率；启动子的正常启动速率；为蛋白质降解速率与为蛋白质降解速率与mRNAmRNA降降解速率的比值；解速率的比

19、值；n n为希尔系数。模型中认为三种启动子的为希尔系数。模型中认为三种启动子的最大转录量、阻遏子基因的调控作用以及蛋白质的翻译最大转录量、阻遏子基因的调控作用以及蛋白质的翻译速率均相同速率均相同。Repressilator稳定性随参数变化的状态图稳定性随参数变化的状态图基因表达过程中随机性基因表达过程中随机性1.1.阻遏蛋白与启动子不同位点的结合阻遏蛋白与启动子不同位点的结合2.2.阻遏蛋白从启动子上第一个位点脱落阻遏蛋白从启动子上第一个位点脱落3.3.阻遏蛋白从启动子上第二个位点脱落阻遏蛋白从启动子上第二个位点脱落4.4.从未结合阻遏蛋白的启动子上进行转录从未结合阻遏蛋白的启动子上进行转录5

20、.5.从被蛋白阻遏的启动子上进行转录、翻译从被蛋白阻遏的启动子上进行转录、翻译6.6.蛋白质以及蛋白质以及mRNAmRNA的降解等的降解等确定性模型和随机模型仿真结构图确定性模型和随机模型仿真结构图AB三三.功能检测功能检测Repressilator荧光检测结果荧光检测结果考虑细胞分裂因素的考虑细胞分裂因素的RepressilatorRepressilator荧光检测结荧光检测结果（横坐标为时间果（横坐标为时间/min/min，纵坐标为荧光量），纵坐标为荧光量）两个两个RepressilatorRepressilator细胞的荧光检测结果细胞的荧光检测结果细胞群体系统脉冲发生器细胞群体系统脉冲

21、发生器 前面讲述的经典实例都是在单个细胞内构建遗前面讲述的经典实例都是在单个细胞内构建遗传线路，不涉及细胞群体间的信号交流和通信。传线路，不涉及细胞群体间的信号交流和通信。然而，细胞协同操作共同完成特定任务是工业化然而，细胞协同操作共同完成特定任务是工业化的必然趋势和要求，构建协调细胞群体操作的时的必然趋势和要求，构建协调细胞群体操作的时空信号系统则显得尤为重要。如同在大规模和超空信号系统则显得尤为重要。如同在大规模和超大规模电子线路中一样，在生物系统中，脉冲信大规模电子线路中一样，在生物系统中，脉冲信号仍然是重要的同步时钟信号。因此合成生物学号仍然是重要的同步时钟信号。因此合成生物学家开发了

22、许多生物脉冲发生器，其中不乏各种精家开发了许多生物脉冲发生器，其中不乏各种精巧的单细胞系统和具有特殊功能的细胞群体系统。巧的单细胞系统和具有特殊功能的细胞群体系统。下面我们以细胞群体系统脉冲发生器为例，降解下面我们以细胞群体系统脉冲发生器为例，降解脉冲发生器遗传线路的设计和构建脉冲发生器遗传线路的设计和构建细胞群体系统脉冲发生器组成细胞群体系统脉冲发生器组成 细胞群体系统脉冲发生器由细胞群体系统脉冲发生器由“信号发生细胞信号发生细胞”和和“脉冲发生细胞脉冲发生细胞”两种细胞构成两种细胞构成：细胞群体系统脉冲发生器机理细胞群体系统脉冲发生器机理细胞群体系统脉冲发生器遗传路线图细胞群体系统脉冲发生器遗传路线图脉冲发生细胞系统参数变化对于脉冲响应的影响脉冲发生细胞系统参数变化对于脉冲响应的影响不同输入浓度和速率对脉冲响应的影响不同输入浓度和速率对脉冲响应的影响Thanks for your attention