实验一 质粒DNA的提取和鉴定精品文稿.ppt

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1、实验一 质粒DNA的提取和鉴定第1页，本讲稿共39页分子生物学分子生物学从从分子水平分子水平上研究生命现象物质基础的学上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。生理功能，以及细胞信号的转导等。第2页，本讲稿共39页基基因因工工程程第3页，本讲稿共39页移液器和EP管第4页，本讲稿共39页质质 粒

2、粒质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸物质。物质。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。性等。F质粒质粒(又称又称F因子或性质粒因子或性质粒)、R质粒质粒(抗药性因子抗药性因子)和和Col质粒质粒(产大肠杆菌素因子产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。等都是常见的天然质粒。能稳定地能稳定地独立存在独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染

3、色体上。整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是含抗生素抗性基因，是重组重组DNADNA技术技术中重要的工具。中重要的工具。第5页，本讲稿共39页分类：分类：单拷贝质粒；单拷贝质粒；多拷贝质粒多拷贝质粒；紧密控制型；紧密控制型；松弛控制型；松弛控制型；第6页，本讲稿共39页第7页，本讲稿共39页质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法碱裂解法；碱裂解法；煮沸裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；酚氯仿抽提法；概括起来主要是用非离子型或离子型概括起来主要是用非离子型或离子型去去污剂污剂、有机溶剂或碱有机溶剂或

4、碱进行处理及用进行处理及用加热加热处处理。理。第8页，本讲稿共39页基本思路基本思路1.1.培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2.2.收集和收集和裂解细菌裂解细菌；3.3.分离质粒分离质粒DNADNA(有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNADNA，根，根据实验所需据实验所需)4.4.电泳检测；电泳检测；第9页，本讲稿共39页碱裂解法的基本原理碱裂解法的基本原理十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)可使可使细胞膜裂解细胞膜裂解。经经SDSSDS处理后，细菌染色体处理后，细菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎片上，会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体同时由于细菌染色体D

5、NADNA比质粒大得多，易受机械力和核酸比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体染色体DNADNA变性变性，而共价，而共价闭合环状闭合环状DNA(Covalently closed circularDNADNA(Covalently closed circularDNA，简称，简称cccDNA)cccDNA)的两条的两条链不会相互分开。链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNADNA片段难以复性，而是与片段难

6、以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒，而质粒DNADNA双链又恢复原状，双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。第10页，本讲稿共39页实验步骤实验步骤1 1、将含有质粒、将含有质粒DNADNA的细菌在的细菌在LBLB培养基中培养过夜。取培养基中培养过夜。取1.5ml 1.5ml LBLB培培养液养液倒入倒入1.5mleppendorf1.5mleppendorf管中，管中，44下下12000g12000g离心离心3030秒。秒。2 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数

7、分钟，使液体流尽。、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3 3、菌体沉淀重悬浮于、菌体沉淀重悬浮于100l100l100l100l溶液溶液中（需剧烈振荡）。中（需剧烈振荡）。4 4、加入新配制的、加入新配制的溶液溶液200l200l200l200l，盖紧管口，快速温和颠倒，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorfeppendorf管管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2 2分钟。分钟。5 5、加入、加入150l150l150l150l预冷的预冷的溶液溶液，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5 5分钟，分钟，44下下12

8、000g12000g离心离心1010分钟。分钟。6 6、上清液、上清液（450uL450uL450uL450uL）移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积的饱和酚等体积的饱和酚（1:11:1），充分颠倒混匀，），充分颠倒混匀，44下下12000g12000g离心离心1010分钟。分钟。第11页，本讲稿共39页7 7、将水相、将水相（400uL400uL400uL400uL）移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积酚等体积酚/氯仿氯仿，颠倒混匀，颠倒混匀，12000rpm12000rpm离心离心10min10min。8

9、8、将水相、将水相（350uL350uL350uL350uL）移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入2 2倍体积的无水倍体积的无水乙醇乙醇，振荡混匀后置于，振荡混匀后置于-20-20冰箱中冰箱中2020分钟，然后分钟，然后44下下12000g12000g离离心心1010分钟。分钟。9 9、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml 7070乙醇乙醇洗沉淀一次，洗沉淀一次，44下下12000g12000g离心离心5-105-10分钟。分钟。1010、吸除上清液

10、，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥1010分钟或分钟或室温干燥。室温干燥。1111、将沉淀溶于、将沉淀溶于10l TE10l TE10l TE10l TE缓冲液（缓冲液（pH8.0pH8.0，含，含20g/ml 20g/ml RNaseARNaseA）中，储于）中，储于-20-20冰箱中。冰箱中。第12页，本讲稿共39页LBLB液体培养基（液体培养基（Luria-BertaniLuria-Bertani）称取蛋白胨（称取蛋白胨（TryptoneTryptone）10g10g，酵母提取物，酵母提取物（YeastextractYeastex

11、tract）5g5g，NaCl10gNaCl10g，溶于，溶于800ml800ml去去离子水中，用离子水中，用NaOHNaOH调调pHpH至至7.57.5，加去离子，加去离子水至总体积水至总体积1 1升，高压下蒸气灭菌升，高压下蒸气灭菌2020分钟。分钟。第13页，本讲稿共39页溶液溶液I I50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L T r i s.25mmol/L T r i s.ClCl（pH8.0pH8.0），），10mmol/L10mmol/LEDTAEDTA（pH8.0pH8.0）。）。溶液溶液可成批配制，每瓶可成批配制，每瓶100ml100ml，高压灭菌高压

12、灭菌1515分钟，储存于分钟，储存于44冰箱冰箱溶液溶液I I：重悬细菌；：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；TrisTrisHClHCl：缓冲体系；：缓冲体系；EDTAEDTA：螯合金属离子；：螯合金属离子；第14页，本讲稿共39页溶液溶液0.2mol/L0.2mol/LNaOHNaOH（临用前用临用前用10mol/LNaOH10mol/LNaOH母液稀释），母液稀释），1 1SDSSDS溶液溶液IIII破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNADNA和蛋白质；和蛋白质；SDSSDS破膜作用，变性蛋白质；破膜作用，变性蛋白质；NaOHNaOH破膜，变性基因

13、组破膜，变性基因组DNADNA；第15页，本讲稿共39页溶液溶液5mol/LKAc60ml5mol/LKAc60ml，冰醋酸冰醋酸11.5ml11.5ml，H2O H2O 28.5ml28.5ml，定容至定容至100ml100ml，并高压灭菌。溶液并高压灭菌。溶液终浓度为：终浓度为：K+3mol/LK+3mol/L，Ac5mol/LAc5mol/L。溶液溶液IIIIII中和溶液，复性质粒中和溶液，复性质粒DNADNA；第16页，本讲稿共39页酚酚/氯仿（氯仿（1:11:1）u酚酚变性蛋白质；变性蛋白质；u氯仿氯仿萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚；分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿分为两层，上层为

14、水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。混合液。吸取时不要震荡。第17页，本讲稿共39页乙醇乙醇u无水乙醇（无水乙醇（2 2倍体积）倍体积）沉淀质粒沉淀质粒DNADNA；u70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀，沉淀，除去沉淀中的盐分；除去沉淀中的盐分；第18页，本讲稿共39页第19页，本讲稿共39页核酸的定量260 nm，1OD值相当于：值相当于：双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml单链单链DNA浓度为浓度为40 g/mlA260/A280=1.8（DNA）A260/A280=2.0（RNA）第20页，本讲稿共39页电电 泳泳 Electrophoresis 第21页，本

15、讲稿共39页一、定义一、定义电泳电泳带电粒子在直流电场中向着电性相带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。反电极移动的现象。电泳分析技术电泳分析技术利用电泳现象进行物质分利用电泳现象进行物质分离的技术。离的技术。第22页，本讲稿共39页二、电泳分析技术发展概况二、电泳分析技术发展概况 1809年年 发现电泳现象发现电泳现象 1937年年 Tiselius 自由界面电泳自由界面电泳 1948年年 Wieland 滤纸电泳滤纸电泳 1980年年 毛细管电泳毛细管电泳 (capiliary electrophoresis)第23页，本讲稿共39页三、电泳分析技术的分类三、电泳分析技术的分类1

16、.1.1.1.根据被分离样品的量多少根据被分离样品的量多少根据被分离样品的量多少根据被分离样品的量多少 分析电泳分析电泳分析电泳分析电泳 制备电泳制备电泳制备电泳制备电泳2.2.2.2.根据电泳电压的高低根据电泳电压的高低根据电泳电压的高低根据电泳电压的高低 常压电泳常压电泳常压电泳常压电泳 0 0 0 0500 500 500 500 V V V V 高压电泳高压电泳高压电泳高压电泳 500 500 500 5003000300030003000V V V V3.3.3.3.根据电泳中是否使用支持物根据电泳中是否使用支持物根据电泳中是否使用支持物根据电泳中是否使用支持物 自由电泳自由电泳自由

17、电泳自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。不使用支持物，在溶液中进行。不使用支持物，在溶液中进行。不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳区带电泳区带电泳区带电泳使用支持物使用支持物使用支持物使用支持物第24页，本讲稿共39页4.4.按支持物的物理性状不同按支持物的物理性状不同a)a)滤滤纸纸及及其其他他纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳，如如醋醋酸酸纤纤维维素素、玻玻璃璃纤纤维维、聚氯乙烯纤维聚氯乙烯纤维b)b)凝凝胶胶电电泳泳，如如琼琼脂脂、琼琼脂脂糖糖、硅硅胶胶、淀淀粉粉胶胶、聚聚丙丙烯烯酰酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳c)c)粉末电泳，粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳d)d)丝状

18、电泳丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳如尼龙丝、人造丝电泳第25页，本讲稿共39页5.5.按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同a)平板式电泳平板式电泳b)垂直板式电泳垂直板式电泳c)垂直柱式电泳垂直柱式电泳第26页，本讲稿共39页6 6.根据电泳系统根据电泳系统pHpH是否连续是否连续连续连续pHpH电泳电泳指电泳过程中指电泳过程中pHpH保持不变；保持不变；不不连连续续pHpH电电泳泳指指电电极极缓缓冲冲液液和和电电泳泳支支持持物物的的不不同同区段也有不同的区段也有不同的pHpH ；第27页，本讲稿共39页电泳技术的特点电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离凡是带电物质

19、均可应用某一电泳技术进行分离,并并可进行定性或定量分析可进行定性或定量分析;样品用量极少样品用量极少;设备简单设备简单;可在常温进行可在常温进行;操作简便省时操作简便省时;分辨率高分辨率高.第28页，本讲稿共39页四、电泳的基本原理四、电泳的基本原理 一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。便会向正极或负极移动。便会向正极或负极移动。便会向正极或负极移动。第29页，本讲稿共39页移动速度移动速度以蛋白质分子为例以蛋白质分子为例:F=EQ

20、F=EQ F=EQ F=EQ （Q QQ Q：有效电荷有效电荷有效电荷有效电荷;E;E;E;E：电位梯度）电位梯度）电位梯度）电位梯度）F F F F=6=6=6=6 r r r r v v v v （FFFF：摩摩摩摩擦擦擦擦阻阻阻阻力力力力;v v v v：在在在在介介介介质质质质粘粘粘粘度度度度 中中中中半半半半径径径径为为为为r r r r的颗粒的移动速度）的颗粒的移动速度）的颗粒的移动速度）的颗粒的移动速度）F=F F=F F=F F=F EQ=6 EQ=6 EQ=6 EQ=6 r r r r v v v v E Q E Q E Q E Q v=v=v=v=6 6 6 6 r r r

21、 r 第30页，本讲稿共39页 迁迁移移率率（Mobility)Mobility)带带电电颗颗粒粒在在单单位位电场强度下的泳动速度。电场强度下的泳动速度。V QV Q M=M=E 6 E 6 r r 第31页，本讲稿共39页五、影响电泳速度的因素五、影响电泳速度的因素1.1.电场强度（电场强度（E E）E E电流电流热效应热效应支持介质上的水分蒸发支持介质上的水分蒸发样品的热变性样品的热变性 EE电电泳泳速速度度慢慢延延长长电电泳泳时时间间样样品品扩扩散散区区带带模模糊糊不清不清分辨率下降分辨率下降2.2.带点颗粒的半径带点颗粒的半径 r r 阻力阻力电泳速度变慢电泳速度变慢3.3.支持物介质

22、支持物介质吸附作用；电渗作用；分子筛作用吸附作用；电渗作用；分子筛作用4 4缓冲液缓冲液 离离子子强强度度（I I）：IIII缓缓缓缓冲冲冲冲能能能能力力力力越越越越大大大大缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液所所所所载载载载的的的的分分分分电电电电流流流流增增增增加，而样品所载的电流相应减少加，而样品所载的电流相应减少加，而样品所载的电流相应减少加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢电泳速度减慢电泳速度减慢电泳速度减慢 pHpH：pHpHpHpH值值值值决决决决定定定定了了了了化化化化合合合合物物物物解解解解离离离离的的的的程程程程度度度度，也也也也决决决决定定定定了了了了质质质质点点点点所所所所带带

23、带带的的的的净净净净电荷。电荷。电荷。电荷。第32页，本讲稿共39页电泳电泳在一定电场强度下，在一定电场强度下，DNADNA分子的迁移取决于分子筛效分子的迁移取决于分子筛效应，即应，即DNADNA分子本身的分子本身的大小大小和和构型构型(相对分子质量不同相对分子质量不同的的DNADNA片段泳动速度不一样片段泳动速度不一样)，且，且DNADNA分子的迁移速度分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳凝胶电泳不仅可分离不仅可分离不同相对分子质量不同相对分子质量的的DNADNA，也可以，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的分离相对分子质量相同，但构

24、型不同的DNADNA分子。分子。第33页，本讲稿共39页琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为因此琼脂糖凝胶可作为分子筛分子筛，常用于，常用于凝胶层析和电凝胶层析和电泳泳。第34页，本

25、讲稿共39页电泳鉴定电泳鉴定其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快；泳动最快；其次为其次为线性结构；线性结构；最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体（没有复制完的两（没有复制完的两个质粒连在一起）；个质粒连在一起）；第35页，本讲稿共39页染料染料EBEB溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料）是一种荧光染料(3,8-(3,8-二氨二氨基基-5-5-乙基乙基-6-6苯基菲啶溴盐苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。下，发出橙色荧光。第36页，本讲稿共39页第37页，本讲稿共39页注意注意EBEB是诱变剂，配制和使用是诱变剂，配制和使用EBEB染色液时，应染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EBEB的的器皿或物品，必须进行清洗或弃去。器皿或物品，必须进行清洗或弃去。第38页，本讲稿共39页第39页，本讲稿共39页