生化分析仪检测原理精品文稿.ppt

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1、生化分析仪检测原理第1页，本讲稿共59页全自动生化分析仪全自动生化分析仪第2页，本讲稿共59页生化分析仪特点优点亮点亮点自动化机械化的仪器设备模仿 代替手工操作提高了工作效率 减少了主观误差灵敏 准确 快速 标准化第3页，本讲稿共59页生化分析仪分类1按结构原理分管道连续流动式分立式常用离心式干片式急诊常用2按测定速度分小型中型大型超大型（模块式）3按自动化程度分半自动全自动第4页，本讲稿共59页2004 生化分析仪主要构成生化分析仪主要构成加样系统供排水系统构成构成比色系统光源 比色杯 单色器 检测器数据处理系统样品转盘 试剂仓 取样装置第5页，本讲稿共59页基本原理临床生化分析仪最常使用的

2、是分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。第6页，本讲稿共59页分光光度计组成光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器记录装置记录装置记录装置记录装置滤光器滤光器滤光器滤光器第7页，本讲稿共59页光吸收曲线溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。在分光光度法中,以吸光度为纵坐标,以波长为横坐标作图可得光吸收曲线。浓度不同的同种溶液,在该种曲线中其最大吸收波长相同，相应的吸光度大小则不同，同一波长下摩尔吸数相同。第

3、8页，本讲稿共59页Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚度成正比 A=kcbA-吸光度 k-吸光系数 c-溶液浓度 b-液层厚度第9页，本讲稿共59页吸光系数定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测得的吸光度。K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。第10页，本讲稿共59页讨 论：1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）:入射光为单色光溶液是均匀，无散射溶液2.该定律适用于固体、液体和气体样品3.在同一波长下，各

4、组分吸光度具有加和性，如果 溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即：A（a+b+c）AaAbAc应用：多组分测定第11页，本讲稿共59页定量分析方法(1)标准曲线法(2)标准溶液对比法(3)吸光系数法第12页，本讲稿共59页标准曲线法最经典方法前提：固定仪器和固定条件 A=K*BC 过程：配置标准溶液系列 分别测定 A 得CA曲线 样品 测定A样 查得C样第13页，本讲稿共59页标准溶液对比法在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的样品溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax，依据朗伯-比尔定律

5、得:As=Kbcs Ax=Kbcx 则:cx=cs*Ax/AsX第14页，本讲稿共59页吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式AKbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长 处的吸光系数 或 ,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：或第15页，本讲稿共59页检测方法1.终点法 2.固定时间法3.连续监测法 第16页，本讲稿共59页 终点法 终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量的一类分析方法。反应混合物进行一定时间反应后，达到平衡终点，即在显色反应处于稳定阶段时，监测其颜色对光的吸

6、收强度，以此计算待测物浓度。终点时间的确认：一、根据时间-吸光度曲线 如:Trinder（偶联终点比色法）反应测尿酸，反应曲线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定 如:溴甲酚绿法测血清白蛋白 第17页，本讲稿共59页分 类终点法：一点终点法 二点终点法 免疫比浊法 双波长法第18页，本讲稿共59页一点终点法一点终点法在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时，选择一个时间点测定吸光度值。通常在反应终点附近连续读两个吸光度，求出两点的平均值，并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。第19页，本讲稿共59页一点终点法的设置：以R和S混合之

7、前的空气空白、水空白或试剂空白的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且成直线，对于反应速度比较快的实验多用。多见于单试剂项目，如：总蛋白，白蛋白等。第20页，本讲稿共59页2023/2/521Am T（时间）（时间）AS+R(吸吸光光度度）一点终点法反应曲线 计算公式：C=(Am-Ab)*KAm-终点读数点的吸光 Ab-试剂空白吸光度 K-校正系数第21页，本讲稿共59页TP反应曲线蛋白质+Cu2+Cu-蛋白质络合物 550nm处吸收峰第22页，本讲稿共59页二点终点法第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度Am，经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光

8、度值An,利用两吸光度之差计算结果。第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等的干扰。第23页，本讲稿共59页AnTAR2AmS+R1(吸吸光光度度）（时间）（时间）两点终点两点终点样本空白样本空白=S+R1S+R1+R2（体积校正因子）（体积校正因子）k0 计算公式计算公式 C=(An-K0*Am)*K 第24页，本讲稿共59页CRE反应曲线肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反应生成红色醌类物质，在540nm处有吸收峰。第25页，本讲稿共59页Mg反应曲线在碱性溶液中，Mg与二甲苯

9、胺蓝形成重氮盐类的紫色复合物，Mg2+浓度可由二甲苯胺蓝吸光度的下降，通过光度测定法来测定。第26页，本讲稿共59页免疫比浊法 通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的 方法：散射比浊：特定蛋白分析仪 透射比浊：自动生化分析仪 通常作两点终点法分析，多采用多点校准。应用：用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/透射强度与抗原量成正比。第27页，本讲稿共59页免疫比浊法优点：方法简便 结果准确 可用于自动化仪器检测缺点：抗体用量大 达平衡时间长第28页，本讲稿共59页双波长法 消除样品

10、中对测定有干扰的物质的影响；在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长1作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长2，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。试样溶液在2和1两个波长处的吸光度之差，只与待测组分的浓度成正比，而与干扰组分的浓度无关第29页，本讲稿共59页干扰物质1.脂血：吸收光谱300-600nm呈下降趋势2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰3.胆红素：300-500nm有吸收峰 可见它们的吸收峰都较宽，且同测定波长有重叠现象。第30页，本讲稿共59页双波长法双波长测定优点：消

11、除噪音干扰 减少杂散光影响 减少样品本身光吸收的干扰 第31页，本讲稿共59页固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，利用这两点吸光度差值计算结果。如：苦味酸法测肌酐 计算公式：C=(A2-A1)*KA1A2T(吸吸光光度度）第32页，本讲稿共59页 测测定定底底物物的的消消耗耗或或产产物物生生成成的的速速度度的的化化学学方方法法称称为为连连续续监监测测法法（又又称称动动态态分分析析法法、速速率率法法或或动动力力学学法法）。在在反反应应速速度度恒恒定定期期（零零级级反反应应期期）来来连连续续观观察察和和记记录录一一定定反反应应时时间间内内底底物

12、物或或产产物物量量的的变变化化。通通过过测测定定一一段段时时间间内内吸吸光光度度的的变化速率（变化速率（A/min A/min）来计算待测物的浓度。）来计算待测物的浓度。酶活性测定如（酶活性测定如（ALTALT、ASTAST、ALPALP、GGTGGT等）常用等）常用连续监测法（速率法）连续监测法（速率法）第33页，本讲稿共59页酶促反应曲线第34页，本讲稿共59页连续监测法 即零级反应速率法,亦称斜率法 在较长反应时间区段内(90-180秒)，每隔一定时间(530秒)读取一次吸光度值，至 少读取4点，得到3个以上A，最后算出 反应速率A/min。第35页，本讲稿共59页第36页，本讲稿共59

13、页酶促反应进程曲线第37页，本讲稿共59页2023/2/538A1TAS+R1R2A2(吸吸光光度度）（时间）（时间）连续监测法连续监测法A/min=(A2-A1)-(空白空白)/(t2-t1)t2t1第38页，本讲稿共59页连续监测法特点 与固定时间法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应。第39页，本讲稿共59页典型酶联法反应曲线第40页，本讲稿共59页ALT反应曲线第41页，本讲稿共59页AMY反应曲线第42页，本讲稿共59页生化结果报告审核责任心不强，未对结果

14、进行认真审核责任心不强，未对结果进行认真审核对检测仪器或试剂方法学不够了解对检测仪器或试剂方法学不够了解工作经验不足工作经验不足对仪器检测的结果及室内质控结果过于相信对仪器检测的结果及室内质控结果过于相信第43页，本讲稿共59页1.结合质控判断结果在控在控GLO=TPALB偏高第44页，本讲稿共59页2.结合临床资料审核结合病人的性别、年龄、临床诊断、其他检查结果审核结合病人的性别、年龄、临床诊断、其他检查结果审核 例例：某某病病人人检检测测的的TPTP为为110g/L110g/L，该该标标本本没没有有脂脂血血等等影影响检测结果的因素响检测结果的因素 临床诊断：多发性骨髓瘤临床诊断：多发性骨髓

15、瘤 另：胰岛素与低血糖、病人输注药物对结果的影响另：胰岛素与低血糖、病人输注药物对结果的影响第45页，本讲稿共59页检验项目间的内在联系各检测参数间存在大小、比例、逻辑关系各检测参数间存在大小、比例、逻辑关系例：例：TC HDL-C+LDL-CTC HDL-C+LDL-C、TBI DBI TBI DBI CK CK-MB CK CK-MB LDHLDH-HBDH-HBDH第46页，本讲稿共59页影响检验结果的因素 试剂线性范围：试剂线性范围：了了解解检检验验项项目目试试剂剂的的线线性性范范围围，对对超超过过或或低低于于范范围围的的项项目目，必必须须进进行行相相应应的的减减量量稀稀释释或或增增量

16、量后后重重新测定。新测定。第47页，本讲稿共59页线性范围 在在实实际际工工作作中中，用用连连续续监监测测法法会会遇遇到到检检验验结结果果为为0 0或或者者负负值值的的情情况况，此此时时不不能能盲盲目目相相信信该该结结果果低就出具低值报告，应查看其反应曲线低就出具低值报告，应查看其反应曲线例：某病人的尿液例：某病人的尿液AMYAMY检测结果为检测结果为0U/L0U/L 其反应曲线如下图：其反应曲线如下图：第48页，本讲稿共59页AMY反应曲线第49页，本讲稿共59页AMY反应曲线分析分析：由于测定物质浓度过高分析：由于测定物质浓度过高处处理理：对对测测定定物物质质进进行行十十倍倍左左右右的的稀

17、稀释释再再测测定定，直直到反应曲线恢复正常结果才可靠到反应曲线恢复正常结果才可靠第50页，本讲稿共59页AMY反应曲线第51页，本讲稿共59页AMY反应曲线第一次稀释后第52页，本讲稿共59页检测项目的方法学 分分析析：CKCK是是由由M M和和B B两两类类亚亚基基组组成成的的二二聚聚体体，其其构构成成为为CK-MB(CK-MB(心心型型)约约占占0-3%0-3%、CK-MM(CK-MM(肌肌型型)约约占占97-100%97-100%、CK-BB CK-BB（脑型）约占（脑型）约占0-1%0-1%第53页，本讲稿共59页影响检验结果的因素 检测项目的方法学：检测项目的方法学：要了解该项目试剂

18、采用的方法学：要了解该项目试剂采用的方法学：例例：某某病病人人在在测测定定心心肌肌酶酶谱谱时时，其其CK:246U/LCK:246U/L、CK-CK-MB:286U/LMB:286U/L，标标本本无无溶溶血血等等因因素素影影响响,其其结结果果中中CK-CK-MBMBCKCK第54页，本讲稿共59页CK-MBCK-MB采用的检测方法为免疫抑制法采用的检测方法为免疫抑制法 正正常常人人体体中中，CKCK同同工工酶酶中中CK-MMCK-MBCK-BB,CK-MMCK-MBCK-BB,其其中中CK-BBCK-BB含含量量极极少少，可可忽忽略略。免免疫疫抑抑制制法法正正是是建建立立于于忽忽略略CK-BB

19、CK-BB的的基基础础上上。采采用用抗抗体体抑抑制制其其M M亚亚基基活活性性，使使CK-MMCK-MM失失去去活活性性，而而CK-MBCK-MB失失去去一一半半的的活活性性。单单测测定定B B亚基的活性，其结果亚基的活性，其结果22即为即为CK-MBCK-MB活性。活性。由于在患轻度或中度脑损伤、脑血管意外及脑手术后由于在患轻度或中度脑损伤、脑血管意外及脑手术后 造造成脑组织发生实质性损害的病人中，成脑组织发生实质性损害的病人中，CK-BB会升高，这会升高，这时该方法测定的时该方法测定的CK-MB的活性相当于是的活性相当于是CK-MB+2CK-BB的活性之和，造成的活性之和，造成CK-MB活

20、性活性假性升高。假性升高。第55页，本讲稿共59页检验标本的影响 标标本本脂脂血血会会使使反反应应浊浊度度增增加加，透透光光度度下下降降，吸吸光光度度增增加加，从从而而造造成成检检验验结结果果不不准准确确。如如TPTP、TGTG、UAUA显著增高，显著增高，GGTGGT显著下降或为显著下降或为0 0 标标本本溶溶血血会会使使K K+、ALTALT、ASTAST、LDHLDH等等检检验验结结果果显显著升高著升高抗凝剂的错误使用抗凝剂的错误使用第56页，本讲稿共59页仪器性能影响 仪仪器器老老化化、故故障障、清清洗洗管管道道堵堵塞塞、水水质质不不纯纯等等均均会会对对检验结果造成影响检验结果造成影响

21、 光光路路老老化化：表表现现为为CK-MB,ALP,ALTCK-MB,ALP,ALT、ASTAST等等项项目目结结果果重复性较差重复性较差 水水质质不不纯纯、反反应应杯杯清清洗洗不不干干净净：表表现现为为无无机机物物质质结果不准结果不准第57页，本讲稿共59页检验结果的总体趋势 即即使使质质控控在在控控，也也要要注注意意当当日日检检验验结结果果的的总总体的分布趋势体的分布趋势 如如K K+的的参参考考区区间间为为3.55.53.55.5，中中值值为为4.54.5，如如果果当当日日结结果果大大部部分分甚甚至至全全部部低低于于4.54.5，即即使使当当日日质质控控在在控控，任要考虑结果是否偏低，应

22、重新校准、质控后再测定任要考虑结果是否偏低，应重新校准、质控后再测定 如如在在质质控控中中TC(-1S),HDL(+1S),LDL(+1S),TC(-1S),HDL(+1S),LDL(+1S),虽虽然然在在控控，如如出出现现大大部部分分HDL+LDLHDL+LDLTCTC，也也应应考考虑虑重重新新对对三三项项目目校校标、质控后再测定标、质控后再测定第58页，本讲稿共59页 总结不要盲目相信仪器检测的结果一定准确不要盲目相信仪器检测的结果一定准确检验人员要增强对报告审核的责任心检验人员要增强对报告审核的责任心检检验验人人员员应应加加强强对对专专业业知知识识的的学学习习和和掌掌握握,了了解解仪仪器的性能及各项目的方法学和反应原理器的性能及各项目的方法学和反应原理对检验标本的状态要认真确认对检验标本的状态要认真确认对有疑问或报警的结果要查看反应曲线对有疑问或报警的结果要查看反应曲线加强与临床科室的沟通加强与临床科室的沟通第59页，本讲稿共59页