流式细胞术实验方法及应用PPT学习教案.pptx

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1、会计学1流式细胞术实验方法流式细胞术实验方法(fngf)及应用及应用第一页，共77页。科研型科研型 分选功能分选功能(gngnng(gngnng)488nm488nm激光激光 四色荧光四色荧光(525(525、575575、610610、675nm675nm）第1页/共77页第二页，共77页。一、流式细胞术的原理一、流式细胞术的原理(yunl)流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色(rns)的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。第2页/共77页

2、第三页，共77页。前向散射(snsh)激光(jgung)第3页/共77页第四页，共77页。FCMFCM的液流系统（如何形成的液流系统（如何形成(xngchng)(xngchng)单个细胞流）单个细胞流）样本样本(yngbn(yngbn)管管鞘液管鞘液管第4页/共77页第五页，共77页。近近30年来流式细胞术在我年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范国得到很快的发展，应用范围不断围不断(bdun)增大。目前，增大。目前，流式细胞术作为一门生物检流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学学、细

3、胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究等临床医学和基础医学研究领域。领域。第5页/共77页第六页，共77页。二、流式细胞术的特点二、流式细胞术的特点(tdin)、优点优点速度快速度快速度快速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。多参数分析多参数分析多参数分析多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特

4、性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息胞多种信息胞多种信息胞多种信息(xnx)(xnx)，也可以根据其细胞表面标志的不，也可以根据其细胞表面标志的不，也可以根据其细胞表面标志的不，也可以根据其细胞表面标志的不同把同把同把同把细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。第6页/共77页第七页，共77页。定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞通过通过通过通过(tnggu)(tnggu)(tnggu)(tnggu)荧光染色对单细胞的某些成分，如：荧光染色对单细胞的某些成分，如：荧光染色对单细胞的某些成分，如：荧光

5、染色对单细胞的某些成分，如：DNADNADNADNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。、抗原或受体等进行定性、定量分析。、抗原或受体等进行定性、定量分析。、抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于60060060010 S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5第40页/共77页第四十一页，共77页。2 2、淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群分析分析(fnx)(fnx)白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（

6、CDCD分子）的命名：分子）的命名：19821982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为分化抗原反应性的类型划分为2525群，把每一群抗体称为一个分化抗体群，把每一群抗体称为一个分化抗体群群(Cluster of Differentiation(Cluster of Differentiation，CD)CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由体的国际命名法。由CDCD抗体群识别的分化抗原就称为抗体群识别的分化抗原就称为CDCD分子。目前分子。目前(

7、mqin)(mqin)已有已有339339个分化抗体群被鉴定并命名个分化抗体群被鉴定并命名第41页/共77页第四十二页，共77页。流式细胞结合单克隆抗体技流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志及膜表面标志(biozh)，主要，主要分为分为T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)、B淋淋巴细胞巴细胞(CD19+)、NK细胞细胞(CD16+56+/CD3

8、-)三个亚群。三个亚群。第42页/共77页第四十三页，共77页。CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴细胞淋巴细胞(xbo)（CD3+）淋巴细胞淋巴细胞(xbo)B淋巴细胞淋巴细胞(xbo)（CD19+）NK细胞细胞(xbo)（CD16+56）+第43页/共77页第四十四页，共77页。NKNK细胞细胞(xbo):(xbo):CD(16+56)+/CD3-CD(16+56)+/CD3-B B淋巴细胞淋巴细胞:CD19CD19+/CD3/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-第44页/共77页第四十五页

9、，共77页。外周血淋巴细胞亚群标记方法外周血淋巴细胞亚群标记方法外周血淋巴细胞亚群标记方法外周血淋巴细胞亚群标记方法(fngf(fngf)（表面标记）（表面标记）（表面标记）（表面标记）50ul+10ul 50ul+10ul相应抗体相应抗体相应抗体相应抗体(kngt(kngt)避光孵育避光孵育避光孵育避光孵育15min 15min 加加加加OptiLyes COptiLyes C溶血素溶血素溶血素溶血素250ul 250ul 室温室温室温室温10min 10min PBS PBS洗一次洗一次洗一次洗一次 上机分析上机分析上机分析上机分析抗体抗体抗体抗体(kngt(kngt):):CD4-FIT

10、C/CD8-PE/CD3-PE-CY5 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体三标抗体三标抗体三标抗体(kngt(kngt)CD19-PE/CD3-FITCCD19-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体二标抗体二标抗体(kngt(kngt)CD16+56-PE/CD3-FITCCD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体二标抗体二标抗体(kngt(kngt)IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照同型对照同型对照同型对照第45页/共77页第四十六页，共77页。n n淋巴细胞亚群检测淋巴细胞

11、亚群检测(jin c)(jin c)临临床意义：床意义：n n CD3+CD3+、CD4+CD4+、CD8+CD8+总数降低：总数降低：细胞免疫功能低下细胞免疫功能低下n n CD4+CD4+（CD4+/CD8+CD4+/CD8+）降低或）降低或CD8+(CD8+/CD4+)CD8+(CD8+/CD4+)升高：升高：AIDSAIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等移）、再生障碍性贫血等n n CD4+(CD4+/CD8+)CD4+(CD4+/CD8+)升高或升高或CD8+(CD8+/CD4+)CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身降低：自身n

12、n 免疫性疾、多发性硬化病、自免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血身免疫性溶血性贫血n n CD3+CD4+CD8+T CD3+CD4+CD8+T细胞减少：见细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。不良、严重免疫缺陷病。第46页/共77页第四十七页，共77页。n n NK CD(16+56)+NK CD(16+56)+NK CD(16+56)+NK CD(16+56)+活性低下：肿瘤、白血病、自活性低下：肿瘤、白血病、自活性低下：肿瘤、白血病、自活性低下：肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等身免疫病、免疫缺陷病等身免疫病、免疫缺陷病等

13、身免疫病、免疫缺陷病等n n NK+CD(16+56)+NK+CD(16+56)+NK+CD(16+56)+NK+CD(16+56)+活性增高：多发性骨髓瘤、骨活性增高：多发性骨髓瘤、骨活性增高：多发性骨髓瘤、骨活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感染髓移植感染髓移植感染髓移植感染(gnrn)(gnrn)(gnrn)(gnrn)、感染、感染、感染、感染(gnrn)(gnrn)(gnrn)(gnrn)性疾病（性疾病（性疾病（性疾病（B B B B病毒、病毒、病毒、病毒、疱疹病毒、肺疱疹病毒、肺疱疹病毒、肺疱疹病毒、肺TBTBTBTB）、习惯性流产等）、习惯性流产等）、习惯性流产等）、习惯性流产等n

14、n CD19+B CD19+B CD19+B CD19+B细胞减少：体液免疫抑制细胞减少：体液免疫抑制细胞减少：体液免疫抑制细胞减少：体液免疫抑制n n CD19+B CD19+B CD19+B CD19+B细胞增高：细胞增高：细胞增高：细胞增高：B B B B细胞恶性增殖性疾病（白血病）细胞恶性增殖性疾病（白血病）细胞恶性增殖性疾病（白血病）细胞恶性增殖性疾病（白血病）第47页/共77页第四十八页，共77页。3 3 3 3、白血病免疫白血病免疫白血病免疫白血病免疫(miny)(miny)(miny)(miny)分型分型分型分型 FCM FCM作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技

15、术。利用不作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行(jnxng)(jnxng)分型：髓系、分型：髓系、分型：髓系、分型：髓系、B B淋巴系、淋巴系、淋巴系、淋巴系、T T淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时

16、标记，一线淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆（髓系抗体包括：胞浆（髓系抗体包括：胞浆（髓系抗体包括：胞浆（髓系-MPO-MPO，B B淋巴系淋巴系淋巴系淋巴系-CD79a,T-CD79a,T淋巴系淋巴系淋巴系淋巴系-cyCD3-cyCD3）,胞膜胞膜胞膜胞膜(髓系髓系髓系髓系-CD13CD13、CD117CD117，B B淋巴系淋巴系淋巴系淋巴系-CD19-CD19、CD10,TCD10,T淋巴系淋巴系淋巴系淋巴系-CD3-CD3、CD2)CD2)等等等等第48页/共77页第四十九页

17、，共77页。n n 采用采用采用采用CD45CD45和侧向散射和侧向散射和侧向散射和侧向散射(s(s nsh)(SSCnsh)(SSC）设门技术可将）设门技术可将）设门技术可将）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强大到各细胞群分开，荧光从强大到各细胞群分开，荧光从强大到各细胞群分开，荧光从强大到弱：淋巴细胞群弱：淋巴细胞群弱：淋巴细胞群弱：淋巴细胞群 单核细胞单核细胞单核细胞单核细胞 成成成成熟粒细胞熟粒细胞熟粒细胞熟粒细胞 原原原原/幼细胞幼细胞幼细胞幼细胞(白血病白血病白血病白血病细胞细胞细胞细胞)，而成熟的红细胞和血小，而成熟的红细胞和血小，而成熟的红细胞和血小，而成熟的红细胞和血小板不表

18、达。板不表达。板不表达。板不表达。第49页/共77页第五十页，共77页。正常正常正常正常(zhngchng)(zhngchng)骨髓流式细骨髓流式细骨髓流式细骨髓流式细胞分布图胞分布图胞分布图胞分布图第50页/共77页第五十一页，共77页。各系表达的抗原各系表达的抗原各系表达的抗原各系表达的抗原造血造血造血造血(zo xu)(zo xu)(zo xu)(zo xu)干细胞：干细胞：干细胞：干细胞：CD34CD34CD34CD34、CD33CD33CD33CD33髓系表达髓系表达髓系表达髓系表达 ：CD13CD13CD13CD13、CD14CD14CD14CD14、CD33CD33CD33CD3

19、3巨核细胞巨核细胞巨核细胞巨核细胞 ：CD61CD61CD61CD61、CD41CD41CD41CD41B B B B细胞系：细胞系：细胞系：细胞系：CD10 CD10 CD10 CD10、CD19CD19CD19CD19、CD20CD20CD20CD20T T T T细胞系：细胞系：细胞系：细胞系：CD2CD2CD2CD2、CD3CD3CD3CD3、CD5CD5CD5CD5、CD7CD7CD7CD7NKNKNKNK细胞细胞细胞细胞:CD16:CD16:CD16:CD16、CD56CD56CD56CD56、CD57CD57CD57CD57第51页/共77页第五十二页，共77页。4 4 4 4、

20、细胞因子的检测、细胞因子的检测、细胞因子的检测、细胞因子的检测(jin c)(jin c)(jin c)(jin c)细胞因子（细胞因子（CKCK）主要由）主要由免疫细胞产生，也可由非免免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产细胞等产生。一种细胞可产生多种生多种CKCK，一种，一种CKCK也可由多也可由多种细胞产生。细胞因子分为种细胞产生。细胞因子分为(fn wi)4(fn wi)4类：白细胞介素类：白细胞介素（lLlL）；干扰素（）；干扰素（IFNIFN）；）；造血生长因子；肿瘤坏死因造血生长因子；肿瘤坏死因子（子（TNFTNF）。）。

21、第52页/共77页第五十三页，共77页。血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌 ，同时加入同时加入(jir)(jir)一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞

22、内，通过细胞因子能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。第53页/共77页第五十四页，共77页。第54页/共77页第五十五页，共77页。细胞因子检测细胞因子检测(jin(jin c)c)（IFN-r IFN-r，IL-4IL-4）：）：n n全血或单细胞全血或单细胞全血或单细胞全血或单细胞+刺激素刺激素刺激素刺激素(佛波脂佛波脂佛波脂佛波脂)和阻断剂和阻断剂和阻断剂和阻断剂(莫莫莫莫能霉素能霉

23、素能霉素能霉素)37)37)37)37培养培养培养培养4-6h 4-6h 4-6h 4-6h 加入细胞表面加入细胞表面加入细胞表面加入细胞表面(biomin)(biomin)(biomin)(biomin)抗体抗体抗体抗体(如如如如CD3CD3CD3CD3、CD4/CD8)CD4/CD8)CD4/CD8)CD4/CD8)孵育孵育孵育孵育20-30min PBS20-30min PBS20-30min PBS20-30min PBS洗洗洗洗1 1 1 1次次次次 加固定破膜剂加固定破膜剂加固定破膜剂加固定破膜剂 室温室温室温室温15min 15min 15min 15min 加入加入加入加入IF

24、N-rIFN-rIFN-rIFN-r和和和和IL-4IL-4IL-4IL-4抗体抗体抗体抗体 孵育孵育孵育孵育30min PBS30min PBS30min PBS30min PBS洗两次洗两次洗两次洗两次 FCM FCM FCM FCM。第55页/共77页第五十六页，共77页。结果结果结果结果(ji gu)(ji gu)(ji gu)(ji gu)分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（FSFSFSFS）和侧）和侧）和侧）和侧向散射（向散射（向散射（向散射（SSSSSSSS

25、）圈出淋巴细胞，再用）圈出淋巴细胞，再用）圈出淋巴细胞，再用）圈出淋巴细胞，再用CD3+CD3+CD3+CD3+和和和和SSCSSCSSCSSC设门圈出设门圈出设门圈出设门圈出T T T T淋巴细胞，淋巴细胞，淋巴细胞，淋巴细胞，再用再用再用再用CD8-/CD3+CD8-/CD3+CD8-/CD3+CD8-/CD3+设门选定设门选定设门选定设门选定T T T T淋巴细胞亚群，再分析淋巴细胞亚群，再分析淋巴细胞亚群，再分析淋巴细胞亚群，再分析IL-4+IL-4+IL-4+IL-4+和和和和CD4+/IFN-rCD4+/IFN-rCD4+/IFN-rCD4+/IFN-r淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞（

26、淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4第56页/共77页第五十七页，共77页。5 5 5 5、细胞内、细胞内、细胞内、细胞内Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+浓度浓度浓度浓度Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+超载是细胞损伤的重要标志超载是细胞损伤的重要标志超载是细胞损伤的重要标志超载是细胞损伤的重要标志(biozh)(biozh)(biozh)(biozh)，导，导，导，导致致致致DNADNADNADNA降解，促使细胞凋亡。降解，促使细胞凋亡。降解，促使细胞凋亡。降解，促使细胞凋亡。检测检测检测检测 Fluo-3/Am Fluo-3/Am Fluo-3/Am Fluo-

27、3/Am是高特异性是高特异性是高特异性是高特异性Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+荧光指示剂，能与荧光指示剂，能与荧光指示剂，能与荧光指示剂，能与Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+特异结合。特异结合。特异结合。特异结合。Fluo-3Fluo-3Fluo-3Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AMAMAMAM（乙酰氧甲基），酯化（乙酰氧甲基），酯化（乙酰氧甲基），酯化（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去后就容易跨过质膜进入胞

28、浆，在胞内酯酶的作用下，脱去后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去(tu q)AM(tu q)AM(tu q)AM(tu q)AM重新重新重新重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离与游离钙离子结合，通过检测其

29、荧光强度可反映出细胞内游离与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+浓度的浓度的浓度的浓度的变化。变化。变化。变化。单细胞悬液单细胞悬液单细胞悬液单细胞悬液+flour-3/AM 37C+flour-3/AM 37C+flour-3/AM 37C+flour-3/AM 37C避光孵育避光孵育避光孵育避光孵育40min 40min 40min 40min PBS PBS PBS PBS洗洗洗洗1 1 1 1次次次次 上机检测上机检测上机检测上机检测 第57页/共77页第五十八页，共77页。6 6、线粒体膜电位、线粒体膜电位 线粒体膜电位（线粒体膜电位（

30、线粒体膜电位（线粒体膜电位（MMPMMP）是线粒体功能的重要参）是线粒体功能的重要参）是线粒体功能的重要参）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映接反映接反映接反映(f(f nyng)nyng)线粒体功能及数量，线粒体功能及数量，线粒体功能及数量，线粒体功能及数量，MMPMMP下降，下降，下降，下降，其氧化磷酸化功能障碍，使其氧化磷酸化功能障碍，使其氧化磷酸化功能障碍，使其氧化磷酸化功能障碍，使ATPATP产生减少，导致产生减少，导致产生减

31、少，导致产生减少，导致细胞凋亡和坏死。细胞凋亡和坏死。细胞凋亡和坏死。细胞凋亡和坏死。第58页/共77页第五十九页，共77页。MMPMMP检测检测(jin c)(jin c)原原理及方法：理及方法：Rhodamine123Rhodamine123（罗丹明（罗丹明123123）、）、DiOC6DiOC6、JC-1JC-1等多种亲等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测测 MMP MMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体性，另外线粒体内外膜之间存

32、在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起(yq(yq)培培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。第59页/共77页第六十页，共77页。当当当当MMPMMPMMPMMP降低降低降低降低(jingd)(jingd)(jingd)(jingd)后，线粒体内的荧光素会后，线粒体内的荧光素会后，线粒体内的荧光素会后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低发生外漏，在细胞内荧光强度降低发生外漏，在细胞内荧光强

33、度降低发生外漏，在细胞内荧光强度降低(jingd)(jingd)(jingd)(jingd)。检测其荧光强度能反映线粒体数量和检测其荧光强度能反映线粒体数量和检测其荧光强度能反映线粒体数量和检测其荧光强度能反映线粒体数量和MMPMMPMMPMMP的降的降的降的降低低低低(jingd)(jingd)(jingd)(jingd)或丧失。或丧失。或丧失。或丧失。操作：单细胞悬液（操作：单细胞悬液（操作：单细胞悬液（操作：单细胞悬液（1*10 6 1*10 6 1*10 6 1*10 6）+1umol/L+1umol/L+1umol/L+1umol/L的的的的Rh123 Rh123 Rh123 Rh1

34、23 37 C,30min PBS37 C,30min PBS37 C,30min PBS37 C,30min PBS洗两次洗两次洗两次洗两次 上机检测上机检测上机检测上机检测 第60页/共77页第六十一页，共77页。7 7 7 7、FCM FCM FCM FCM检测细胞检测细胞检测细胞检测细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)凋亡凋亡凋亡凋亡 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身(zshn)(zshn)的程序结束的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主

35、动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。凋亡，从而达到防病、治病的目的。第61页/共77页第六十二页，共77页。（1 1 1 1）Caspase Caspase Caspase Caspase家族家族家族家族(jiz)(jiz)(jiz)(jiz)半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（CaspaseCaspase）以无活性的酶原形）以无活性的酶原形）以无活性的酶原形）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有

36、活性式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的的片段。活化的的片段。活化的的片段。活化的CaspaseCaspase进一步激活其他的进一步激活其他的进一步激活其他的进一步激活其他的CaspaseCaspase前体，形成前体，形成前体，形成前体，形成(xngchng)(xngchng)了级联放大切割过了级联放大切割过了级联放大切割过了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目程，是直接导致凋亡细胞解体的

37、蛋白酶系统，目前已发现前已发现前已发现前已发现1515个个个个CaspaseCaspase家族成员，分别命名为家族成员，分别命名为家族成员，分别命名为家族成员，分别命名为Caspase1-15Caspase1-15。在。在。在。在CaspaseCaspase家族成员中，家族成员中，家族成员中，家族成员中，Caspase-3Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。是最重要的指示蛋白酶。是最重要的指示蛋白酶。是最重要的指示蛋白酶。第62页/共77页第六十三页，共77页。n n操作：操作：操作：操作：n n单细胞悬液（单细胞悬液（单细胞悬液（单细胞悬液（1*10 61*10 61*10 61*10

38、6）固定和破膜剂固定和破膜剂固定和破膜剂固定和破膜剂 冰浴冰浴冰浴冰浴20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer洗两次洗两次洗两次洗两次 20ul20ul20ul20ul单抗单抗单抗单抗 室温孵育室温孵育室温孵育室温孵育(f y)30min (f y)30min (f y)30min (f y)30min Perm/Wash BufferPerm/Wash BufferPerm/Wash BufferPerm/Wash Buffer洗洗洗洗1 1 1 1次次次次

39、 加加加加0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer 上机检测。上机检测。上机检测。上机检测。第63页/共77页第六十四页，共77页。（2 2）凋亡相关凋亡相关基因基因(jyn)(jyn)蛋白蛋白细胞凋亡过程(guchng)中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、ced基因家族等。抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等 染色标记同Caspa

40、se第64页/共77页第六十五页，共77页。（3 3）Fas/Fas/FasLFasL Fas Fas又称又称又称又称APO-1APO-1，即，即，即，即CD95CD95分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。亡受体。亡受体。亡受体。Fas/FasLFas/FasL是凋亡诱导是凋亡诱导是凋亡诱导是凋亡诱导(yud(yud o)o)家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重家族

41、的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子要分子要分子要分子,Fas/FasL,Fas/FasL结合结合结合结合,可向细胞传递死亡信号可向细胞传递死亡信号可向细胞传递死亡信号可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。检测：同表面标记检测：同表面标记检测：同表面标记检测：同表面标记第65页/共77页第六十六页，共77页。（4 4）凋亡凋亡(dio wn)(dio wn)率检测率检测n n被认为被认为被认为被认为(rnwi)(rnwi)比较成熟的方法：比较成熟

42、的方法：比较成熟的方法：比较成熟的方法：PIPI单染色法单染色法Annexin VAnnexin VPIPI双染法。双染法。TUNELTUNEL法法第66页/共77页第六十七页，共77页。n n碘化丙啶（碘化丙啶（碘化丙啶（碘化丙啶（PIPIPIPI）单染法（）单染法（）单染法（）单染法（DNADNADNADNA周期分析）：周期分析）：周期分析）：周期分析）：n n由于凋亡细胞由于凋亡细胞由于凋亡细胞由于凋亡细胞DNADNADNADNA被降解，小分被降解，小分被降解，小分被降解，小分子子子子DNADNADNADNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另可通过细胞膜渗透到细胞外，另可通过细胞膜渗透到细胞外

43、，另可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分外凋亡小体也可带走部分外凋亡小体也可带走部分外凋亡小体也可带走部分DNADNADNADNA，造成凋，造成凋，造成凋，造成凋亡细胞亡细胞亡细胞亡细胞DNADNADNADNA含量减少，与荧光含量减少，与荧光含量减少，与荧光含量减少，与荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)(ynggung)染料结合减少，荧光染料结合减少，荧光染料结合减少，荧光染料结合减少，荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)(ynggung)强度减弱，在强度减弱，在强度减弱，在强度减弱，在DNADNADNADNA直方图上直方图上直方图上

44、直方图上显示在显示在显示在显示在G0/G1G0/G1G0/G1G0/G1峰前出现一个峰前出现一个峰前出现一个峰前出现一个DNADNADNADNA含量减少含量减少含量减少含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。n n 第67页/共77页第六十八页，共77页。第68页/共77页第六十九页，共77页。第69页/共77页第七十页，共77页。n nAnnexin VAnnexin VAnnexin VAnnexin VPIPIPIPI双染法：双染法：双染法：双染法：n n在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早在凋亡细胞的

45、形态学改变中，胞膜的改变是最早在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PSPSPSPS）从细胞膜内层翻转从细胞膜内层翻转从细胞膜内层翻转从细胞膜内层翻转(fn zhun)(fn zhun)(fn zhun)(fn zhun)，暴露在凋亡细胞表面，暴露在凋亡细胞表面，暴露在凋亡细胞表面，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，构成早期凋亡的重要生化特征，构成早期凋亡的重要

46、生化特征，构成早期凋亡的重要生化特征，PSPSPSPS被特异的被特异的被特异的被特异的Annexin V-Annexin V-Annexin V-Annexin V-FITCFITCFITCFITC探针所标记，而探针所标记，而探针所标记，而探针所标记，而PIPIPIPI对细活细胞和早期凋亡细胞是拒对细活细胞和早期凋亡细胞是拒对细活细胞和早期凋亡细胞是拒对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故染的，故染的，故染的，故Annexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PI双染法能区分活细胞、早期双染法能区分活细胞、早期双

47、染法能区分活细胞、早期双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。凋亡细胞和死亡细胞。凋亡细胞和死亡细胞。凋亡细胞和死亡细胞。n n 第70页/共77页第七十一页，共77页。机械机械(jxi)损伤细胞：损伤细胞：Annexin V-/PI+晚期凋亡、坏死细晚期凋亡、坏死细胞：胞：Annexin V+/PI+早期凋亡细胞：早期凋亡细胞：Annexin V+/PI-活细胞：活细胞：Annexin V-/PI-第71页/共77页第七十二页，共77页。第72页/共77页第七十三页，共77页。n nTUNELTUNELTUNELTUNEL法：法：法：法：n n细胞凋亡时，双链细胞凋亡时，双链细胞凋亡时，

48、双链细胞凋亡时，双链DNADNADNADNA会出现断裂点，会出现断裂点，会出现断裂点，会出现断裂点，即产生一系列即产生一系列即产生一系列即产生一系列3 3 3 3 端。在脱氧核糖核酸转移端。在脱氧核糖核酸转移端。在脱氧核糖核酸转移端。在脱氧核糖核酸转移酶酶酶酶(TdT)(TdT)(TdT)(TdT)催化催化催化催化(cu hu)(cu hu)(cu hu)(cu hu)的反应下，能将荧的反应下，能将荧的反应下，能将荧的反应下，能将荧光素光素光素光素-脱氧尿苷三磷酸脱氧尿苷三磷酸脱氧尿苷三磷酸脱氧尿苷三磷酸(dUTP)(dUTP)(dUTP)(dUTP)标记到断裂标记到断裂标记到断裂标记到断裂的

49、的的的DNADNADNADNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。第73页/共77页第七十四页，共77页。第74页/共77页第七十五页，共77页。FCMFCM的临床的临床(ln chun)(ln chun)检测项检测项目目n nHLA-B27HLA-B27HLA-B27HLA-B27n n淋巴细胞亚群（淋巴细胞亚群（淋巴细胞亚群（淋巴细胞亚群（CD3CD3CD3CD3、CD4CD4CD4CD4、CD8CD8CD8CD8、CD16+56CD16+56CD16+56CD16+56、CD19CD19CD19C

50、D19）n n白血病免疫分型（白血病免疫分型（白血病免疫分型（白血病免疫分型（CD2CD2CD2CD2、CD3CD3CD3CD3、CD13CD13CD13CD13、CD14CD14CD14CD14、CD33CD33CD33CD33、CD34CD34CD34CD34、CD117CD117CD117CD117、CD79aCD79aCD79aCD79a、cCD3cCD3cCD3cCD3、MPOMPOMPOMPO等）等）等）等）n n阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（CD55CD55CD55CD55、CD59CD59CD59CD59）n n血小板活化血小板活化血小