分析化学色谱法.pptx

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1、色谱分析基于物质的物理性质进行分离和分析的方法。色谱法是一种分离方法，其特点为存在两相流动相携带试样混合物流过固定相的流体（气体或液体)固定相固定不动的一相将色谱法用于分析中，称为色谱分析碳酸钙石油醚1.概述第1页/共99页样品混合物中各组分性质和结构的差异，与固定相发生作用的大小也有差异二、色谱法分离基本原理1.概述碳酸钙石油醚流动相+样品混合物固定相产生相互的作用不同组分在固定相中的滞留时间不同，按先后次序从固定相中流出实现分离。第2页/共99页三.色谱法的分类 1.概述按流动相状态的不同，可分为:气相色谱法(GC)液相色谱法(LC)超临界流体色谱(SFC)第3页/共99页以气体为流动相的

2、色谱法，简称GC（Gas Chromatography）应用范围：用于分离分析易汽化（在-190 500范围内有0.210mmHg的蒸气压）、热稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)按固定相状态分为1.概述1.气相色谱法第4页/共99页2.液相色谱法 以液体为流动相的色谱法，简称LC（Liquid Chromatography）。应用范围：用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。1.概述分配色谱法吸附色谱法离子色谱法空间排阻色谱法分类第5页/共99页四.色谱分析仪器基本流程气相色谱仪1.概述第6页/共99页液相色谱仪1.概

3、述第7页/共99页流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱混合试样在色谱柱中进行分离混合试样在色谱柱中进行分离各组分依次进入检测器检测各组分依次进入检测器检测检测响应信号导入计算机检测响应信号导入计算机得到色谱图得到色谱图根据色谱图参数进行定性定量分析根据色谱图参数进行定性定量分析流动相进样装置色谱柱检测器数据记录与处理样品色谱分析仪器基本流程1.概述第8页/共99页五.色谱法的特点:优点：分离效能高选择性好灵敏度高分析速度快应用广泛不足之处：定性能力不强分离，分析双重功能1.概述第9页/共99页 关于色谱峰 关于保留值 关于峰宽度 关于色谱曲线的意

4、义一、色谱相关术语2、色谱法基本理论第10页/共99页1.关于色谱峰的术语色谱峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差2、色谱法基本理论第11页/共99页(1)色谱流出曲线 组分浓度（或电信号）随时间的变化曲线(2)基线只有流动相经过检测器时，所产生的信号，反映实验条件的稳定情况。稳定时为直线。EEt正态分布 定性、定量 分离效果显示基线2、色谱法基本理论第12页/共99页2.关于保留值的术语 （1）用时间表示的保留值tR保留时间：进样柱后出现Cmax值时所需时间 tM死时间:不与固定相作用的组分的保留时间t R 调整保留时间:t R=tR-tM进样空气峰tRtRtM第13页/共99页（2）用体积表

5、示的保留值 VR保留体积:VR=tRqv,0 V R调整保留体积:VR=VR-VMVM死体积：VM=tMqv,0 进样空气峰tRtRtMqv,0为为柱出口处的柱出口处的载气流速载气流速,mLminmLmin-1 1 第14页/共99页（3）相对保留值 r21r21 同种固定液对难分离物质对的选择性度量 在气相色谱中，r21的大小仅与固定相种类和柱温有关。在液相色谱中，r21与固定相、流动相及柱温有关。r21是色谱定性的重要参数，实验室之间可通用。r21 越大，两组分分离越容易2、色谱法基本理论第15页/共99页3.关于色谱峰区域宽度的术语（1 1 1 1）标准偏差（）标准偏差（）：）：0.60

6、7h0.607h处峰宽的一半处峰宽的一半反映分离条件的好坏，衡量柱效率反映分离条件的好坏，衡量柱效率 （2 2 2 2）半峰宽）半峰宽（WWh/2h/2）：）：峰高峰高1/21/2处的峰宽处的峰宽t tMMh0.607h0.607h=1/21/2CDCDC CD D1/21/2h hWWh/2 h/2=ABABA AB BW=4W=4Wh/2=WWb b2、色谱法基本理论（3 3）峰底宽度（）峰底宽度（WW）：）：自色谱峰两侧的转折点所作自色谱峰两侧的转折点所作 切线在基线上的截距切线在基线上的截距第16页/共99页 4.色谱曲线的意义 色谱峰数=样品中单组分的最少个数；色谱保留值定性依据；色

7、谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。2、色谱法基本理论第17页/共99页 大窄分离效果一般 窄不够大 较宽较大较宽小峰间距大（t大）峰窄（操作条件）2、色谱法基本理论二.色谱分离的定量指标分离度色谱分离的效果：两组分峰间距足够远每个组分峰宽足够小窄第18页/共99页分离度R上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出R。2、色谱法基本理论定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。第19页/共99页理论上证明:对于峰形对称的色谱峰R=1，分离程度可达98%R=1.5，

8、分离程度可达99.7%R=0.75，不完全分离R=1.5 通常用作是否分开的判据2、色谱法基本理论第20页/共99页 要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，增大r21 是最有效的手段。2、色谱法基本理论 在气相色谱中，增大r21最有效的手段是改变固定相，选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键。在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。改变柱温也可改变r21。第21页/共99页三、色谱定性定量方法1.定性分析(1)利用保留值定性 利用加入法定性：在试样中加入待测组分的纯物质，观察组分色谱峰高的相对变化情况。各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，故

9、可作为定性指标。利用纯物质对照定性 利用文献值对照定性（很少用）2、色谱法基本理论第22页/共99页第23页/共99页l应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。l优点：应用简便，不需要其他仪器。l缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性2、色谱法基本理论第24页/共99页(2)与其他方法结合定性2、色谱法基本理论 混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度 高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。第25页/共99

10、页2.定量分析的方法(1)定量依据:(2)定量步骤:A)峰面积(Ai)的测定和计算B)定量校正因子测量与计算C)选择合适的方法计算组分含量mi=fi.Ai 在一定色谱条件下，被测物质的量与峰面积成正比。定量校正因子2、色谱法基本理论第26页/共99页A）各种峰面积的测量方法峰高峰高 半峰宽半峰宽A Ai i=1.1.065h065hYY1/21/2简单快速简单快速,峰形不峰形不对称时，误差较大对称时，误差较大峰高峰高 平均峰宽平均峰宽A Ai i=1/2(Y=1/2(Y0.150.15+Y+Y0.850.85)h)h结果正确结果正确,测量麻烦测量麻烦峰高峰高 保留时间保留时间A Ai i=hY

11、=hY1/21/2=h b t=h b tR R结果较正确结果较正确,适用适用于同系物分析于同系物分析.用自动积分仪用自动积分仪和色谱工作站和色谱工作站快速快速,简便简便定量准确定量准确峰形峰形计算方法及公式计算方法及公式评价评价狭窄峰狭窄峰各种峰形各种峰形不对称拖尾峰不对称拖尾峰2、色谱法基本理论第27页/共99页B）定量校正因子的测量与计算绝对定量校正因子（fi）指单位峰面积相当的物质量相对定量校正因子（fi）下标下标 s s：标准物：标准物下标下标 i i：被测物：被测物ms 和 mi 准确称取的量（已知）As 和 Ai 色谱图上测得的值2、色谱法基本理论第28页/共99页C）计算组分含

12、量的几种方法归一化法适用条件：试样中各组分全部出峰计算公式：评价：简单，准确。不适用于试样中组分不能全部出峰的情况。2、色谱法基本理论第29页/共99页适用条件：用于测定试样中个别组分具体方法：选用一定量的纯物质作内标（内标物要求试样中不存在的，（内标物要求试样中不存在的，mms s mmi i ，内标，内标物的峰应位于被测组分峰之间或邻近位置。）物的峰应位于被测组分峰之间或邻近位置。）计算公式：评价：不需要测校正因子，定量准确，使用无不需要测校正因子，定量准确，使用无限制。不适应于快速控制分析限制。不适应于快速控制分析2、色谱法基本理论内标法第30页/共99页适用条件：大批量试样的快速分析具

13、体方法：取被测试样的纯物质，制成一系列不同取被测试样的纯物质，制成一系列不同浓度的标准系列，测得相应的峰面积，浓度的标准系列，测得相应的峰面积，作作A Ai i C Ci i%的工作曲线图。在相同条件的工作曲线图。在相同条件下，测定试样下，测定试样A Ai i，由图查出相应的，由图查出相应的C Ci i%。计算公式：评价：不使用校正因子，准确度高。对进样量的准确性要求高。2、色谱法基本理论外标法第31页/共99页一、气相色谱仪的流程气路色谱柱进样检测器数据记录与处理3、气相色谱法第32页/共99页1.1.载气系统载气系统 :形成干净、有恒定压力和流速的载气流，形成干净、有恒定压力和流速的载气流

14、，包括气源、气体净化、气体流速控制和包括气源、气体净化、气体流速控制和测测 量量 2.2.进样系统进样系统:进样器和汽化室，汽化室可控制温度进样器和汽化室，汽化室可控制温度为为2040020400 3.3.色谱柱色谱柱:完成样品的分离，包括柱箱、恒温控制装置完成样品的分离，包括柱箱、恒温控制装置 4.4.检测器检测器:将浓度或质量信号将浓度或质量信号 电信号，包括检测器，电信号，包括检测器，控温装置控温装置 5.记录系统:将电信号放大,记录出色谱图,经数据处理得出结果，现用色谱工作站3、气相色谱法气路色谱柱进样检测器数据记录与处理第33页/共99页二.分离原理3、气相色谱法 气相色谱分离过程是

15、在色谱柱内完成的。固定相固定相固体吸附剂固体吸附剂担体和固定液担体和固定液分离原理分离原理吸附与脱附吸附与脱附溶解与挥发溶解与挥发1.分离原理 第34页/共99页色谱柱组分载气载气易挥发难挥发载气载气（吸附）溶解挥发（脱附）各组分性质和结构的差异，与固定相的作用力不同，使其保留时间不同。溶解（吸附）气固色谱吸附能力不同而分离，与固定相作用力大，脱附难，随载气推进慢，后离柱，tR大。（吸附）溶解挥发（脱附）气液色谱溶解能力不同而分离，与固定相作用力大，挥发难，随载气推进慢，后离柱，tR大。3、气相色谱法第35页/共99页2.分配系数 K：定义：试样在固定相和流动相中分配达到平衡时特征：T，固定相

16、确定，不同物质的 K值不同。K小 Cl 随载气移动快，tR 小，先出峰3、气相色谱法不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不等。两组分分配系数相差越大，两峰分离的就越好。第36页/共99页总结:气相色谱分离的基本原理包括两个方面 色谱过程的热力学因素与试样组分在两相中的分配情况、试样本性及固定相有关。色谱过程的动力学因素与试样在两相中的质量交换情况有关气相色谱的分离原理：不同物质在两相间具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，试样中的各组分在两相中进行反复多次的分配，使原来分配系数只有微小差异的各组分彼此分离开来。3、气相色谱法第37页/共99页三.气相色谱固定相及其选择有活性的多孔固体支持物

17、(担体)+固定液气-固色谱固定相气-液色谱1.气-固色谱活性多孔固体固体吸附剂 硅胶、氧化铝、碳质、分子筛等 高分子聚合物 以二乙烯基苯为单体交联聚合 而成的小球3、气相色谱法第38页/共99页2.气-液色谱担体+固定液提供一个大的惰性表面，承载固定液。3）热稳定性好，有一定的机械强度1）多孔性，表面积大，颗粒及孔径均匀2）表面化学惰性，无吸附和催化性能 功能:要求：分类非硅藻土型担体非硅藻土型担体硅藻土型担体硅藻土型担体红担体（天然红担体（天然硅藻土硅藻土）白担体（天然白担体（天然硅藻土硅藻土 +CaCOCaCO3 3）3、气相色谱法担体第39页/共99页固定液：(1)要求操作温度下，呈液态

18、，粘度低；挥发性小，热稳定性高；能牢固地吸附在担体表面，形成均匀和结构稳定的薄层；化学稳定性好，对组分有适当的溶解能力，并具有高选择性。一般是高沸点有机物3、气相色谱法第40页/共99页固定液类型固定液类型极性极性应用特点应用特点固定液举例固定液举例烃类烃类最弱最弱非极性化合物非极性化合物角鲨烷角鲨烷硅油类硅油类极性范围广极性范围广应用范围广应用范围广SE-30、SE-54聚乙二醇类聚乙二醇类强极性强极性强极性化合物强极性化合物PEG-20M酯类酯类中强极性中强极性价廉价廉苯二甲酸二壬苯二甲酸二壬酯酯腈类腈类强极性强极性极性化合物极性化合物一氧二丙腈一氧二丙腈特殊固定液特殊固定液分离异构体分离

19、异构体有机皂土有机皂土3、气相色谱法(2)固定液分类及其应用第41页/共99页以非极性角鲨烷的P=0 强极性一氧二丙腈P=100为基准，分五级。(3)固定液的极性 固定液的极性大小，关系到固定液的极性大小，关系到各组分在其的溶解能力。极性的表示方式：一般用相对极性（P）表示固定液的极性大小3、气相色谱法第42页/共99页(4)固定液的选择“相似相溶”的原则非极性固定液非极性固定液按沸点由低至高出峰按沸点由低至高出峰极性固定液极性固定液按极性由小至大出峰按极性由小至大出峰中等极性中等极性固定液固定液先非极性，后极性出峰先非极性，后极性出峰氢键型固定液氢键型固定液按氢键由弱至强出峰按氢键由弱至强出

20、峰特殊固定液特殊固定液样品样品固定液固定液试液出峰顺序试液出峰顺序非极性组分非极性组分极性组分极性组分极性和非极极性和非极性的混合物性的混合物含氢键的组分含氢键的组分复杂组分复杂组分3、气相色谱法第43页/共99页3、气相色谱法四.气相色谱检测器 检测器是将色谱柱后流出组分的含量转化为相应的电信号的一种装置。1.热导检测器（TCD）(1)特点 结构简单，通用型检测器，灵敏度低(2)结构第44页/共99页热丝热丝3、气相色谱法第45页/共99页3、气相色谱法第46页/共99页(3)检测原理 基于不同的物质具有不同的热导系数(4)操作条件的选择3、气相色谱法桥流：桥流越大，灵敏度越高，但不能太大，

21、否则热丝会烧断载气种类：使用热导系数大的氢气、氦气作载气时灵敏度高温度：大于或等于柱温第47页/共99页3、气相色谱法2.氢火焰离子化检测器（FID）(1)特点 结构简单，选择性检测器，对有机物响应，灵敏度高(2)结构第48页/共99页3、气相色谱法第49页/共99页(3)原理 蒸气分子受激发后被离子化，在电场作用下定向运动形成离子流，然后进行放大和记录。(4)操作条件的选择气体流量 载气:氢气:空气=1:1:10气体纯度：要求高使用温度：大于803、气相色谱法第50页/共99页1.载气的选择考虑检测器的要求载气本身的性质五.操作条件选择 热导池检测器 常用H2氢火焰离子化检测器常用H2考虑安

22、全性，经济性，易获得3、气相色谱法第51页/共99页2.柱温的选择直接影响分离效能和分析速度柱温，被测定组分挥发度 ，K，tR，分离度，峰易重叠。柱温，分离度，分析时间 ，但峰宽 。3、气相色谱法柱温选择的原则：在使最难分离的组分能尽可能好的分离前提下，尽可能采取较低的柱温，以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。柱温不能高于固定液的沸点，否则挥发流失。第52页/共99页tc=45tc=1203080120180程序升温1.丙烷2.丁烷3.戊烷4.己烷5.庚烷6.辛烷7.溴仿8.间氯甲苯9.间溴甲苯 复杂组分可采用程序升温在 T固定液最高使用温度的前提下，采取较低柱温，以满足最难分离组分得较好分离，峰

23、形不拖尾为度。第53页/共99页一般比柱温高3070汽化温度高为好,但须低于试样分解温度。3.汽化温度的选择4.色谱柱长的选择填充柱13m，内径d=34mm3、气相色谱法5.进样量液样（0.110L），气样（0.210mL）要求动作快、时间短。第54页/共99页3、气相色谱法六.毛细管气相色谱法（1）分离效率高：比填充柱高10100倍；（2）分析速度快：比填充柱色谱分析速度快；（3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温；（4）灵敏度高，一般采用死体积小，灵敏度高的检测器，如FID；1.1.特点第55页/共99页2.与填充柱气相色谱系统的区别3、气相色谱法(1)无填料、阻力小，长可达百米，管径0

24、.2 mm。(2)柱容量小，允许进样量小。(3)总柱效高，分离复杂混合物的能力大为提高。(4)操作条件严格，要求柱外死体积小。(5)在仪器结构上增加了尾吹和分流。第56页/共99页一、概述一、概述GCHPLC应用范围能气化、热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高4、高效液相色谱法1.高效液相色谱与气相色谱的比较第57页/共99页2.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高压：用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱高效：与单位长度气相柱效能比高十多倍高灵敏度：最小检测量可达10-9g，甚至10-11g高速：配备高压输液设备，

25、流速达1ml/min。应用范围广泛：可分析80%有机化合物“四高”“一广”4、高效液相色谱法可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及具有生理活性物质的分析第58页/共99页二.高效液相色谱仪高压输液系统进样系统分离系统检测系统4、高效液相色谱法第59页/共99页1.高压输液系统由储液罐高压输液泵过滤器压力脉动阻力器等组成。高压输液泵恒流泵：输出流量保持恒定恒压泵：输出压力恒定目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。高压输液泵要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，耐腐蚀等。4、高效液相色谱法第60页/共99页2进样系

26、统 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，4、高效液相色谱法进样阀第61页/共99页3.分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件色谱柱柱管：固定相：不锈钢、铝、铜等柱长530cm，内径为45mm常用分离柱：柱体为直型不锈钢管4、高效液相色谱法第62页/共99页4检测系统 检测器仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，如紫外、荧光、电化学检测器等对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。如示差折光，电导检测器等。4、高效液相色谱法第63页/共99页 表表.液相色谱常用检测器的一般性质液相色谱常用检测器的一般性质 检测器检测器检测器检测器选择性选择性选择性选择性梯度洗梯度洗梯度洗梯

27、度洗脱脱脱脱线性范围线性范围线性范围线性范围检测限检测限检测限检测限(g/mL)(g/mL)敏感性敏感性敏感性敏感性 对流速对流速对流速对流速对温度对温度对温度对温度紫外紫外紫外紫外紫外吸紫外吸紫外吸紫外吸收收收收可以可以可以可以10105 52102101010不敏感不敏感不敏感不敏感低低低低示差示差示差示差通用型通用型通用型通用型不可以不可以不可以不可以10104 42102107 7不敏感不敏感不敏感不敏感10104 4荧光荧光荧光荧光荧光物荧光物荧光物荧光物质质质质可以可以可以可以10103 310101111不敏感不敏感不敏感不敏感低低低低电化学电化学电化学电化学电活性电活性电活性电

28、活性不可以不可以不可以不可以10106 610101212敏感敏感敏感敏感1.5%1.5%电导电导电导电导离子离子离子离子不可以不可以不可以不可以2102104 410108 8敏感敏感敏感敏感2%2%4、高效液相色谱法第64页/共99页1.紫外检测器紫外检测器(2)优点：是高效液相色谱仪的标准配置应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高，可检测10-9gmL-1的物质线性范围宽，104105对温度及流动相的流速改变不敏感适合梯度洗提4、高效液相色谱法(1)原理：朗伯比尔定律。第65页/共99页固定波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器二极管阵列检测器(3)紫外检测器分类4、高效液相色谱法第

29、66页/共99页(A)固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器4、高效液相色谱法第67页/共99页(B)(B)可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器4、高效液相色谱法第68页/共99页(C)(C)光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。4、高效液相色谱法第69页/共99页2.差示折光检测器差示折光检测器4、高效液相色谱法(1)原理：通过连续检测参比池和样品池中流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度（折射率差值与浓度呈正比）。(2)特点：通用型检测器（物质具有折射率）灵敏度低、对温度

30、敏感、不能用于梯度洗脱。(3)结构：偏转式、反射式和干涉型三种第70页/共99页4、高效液相色谱法第71页/共99页示差折光检测器第72页/共99页4、高效液相色谱法(1)原理：根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质的含量。(2)特点：广泛用于离子色谱仪中。应用于能电离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。(3)结构：由一对平行的铂电极（表面镀铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测池，两电极构成电桥的一个测量臂。3.电导检测器电导检测器第73页/共99页4、高效液相色谱法(4)响应特性：l选择性检测器，对离子型化合物有响应l灵敏度高l受温度的影响l不能梯度洗提第74页/共99页三三

31、.HPLC主要分离类型及其原理主要分离类型及其原理 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子交换色谱法 体积排阻色谱法 4、高效液相色谱法第75页/共99页 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成固定相的色谱法。特点 1）固定相不易流失，使用周期长 2）固定相的稳定性好，化学性能好 3）柱效高；重现性好；4）载样量大 5）适于梯度洗脱4、高效液相色谱法1.化学键合相色谱法第76页/共99页4、高效液相色谱法根据化学键合相与流动相极性的相对强弱(1)正相键合相色谱法：固定相：极性键合相，如氰基（CN）流动相：非极性或弱极性溶剂，如烷烃适用范围：分离油溶性或水溶性的极性或 强极性化合物分离原理：

32、分配+吸附分离选择性：极性强的组分,后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分tR 减小。第77页/共99页(2)反相键合相色谱法：固定相：非极性键合相，如C8柱，C18柱流动相：极性溶剂，甲醇-水、乙腈-水等适用范围：分离非极性、极性和离子性化合物分离选择性：极性强的组分先洗脱出柱。正相与反相的出峰顺序相反4、高效液相色谱法第78页/共99页(3)固定相固定相4、高效液相色谱法固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。第79页/共99页4、高效液相色谱法 键合固定相类型 非极性键合相：非极性烃如C18,C8与苯基等键合在硅

33、胶表面 用于反相色谱；弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 极性键合相：常用氨基氰基键合相键合硅胶 一般用于正相色谱 第80页/共99页(4)流动相流动相4、高效液相色谱法l要求与固定相不发生化学反应对试样有适宜的溶解度与使用的检测器要有相容性纯度高，粘度小，沸点不能太低，价格便宜第81页/共99页l流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）4、高效液相色谱法第82页/共99页溶剂的种类正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲

34、烷、氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。4、高效液相色谱法第83页/共99页正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相固定相极性极性非极性非极性流动相流动相非极性非极性极性极性溶质分子与固定相溶质分子与固定相作用力作用力极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、氢键）氢键）“强烈强烈”色散力（非选择性）色散力（非选择性）“微弱微弱”溶质分子与流动相溶质分子与流动相作用力作用力色散力（非选择性）色散力（非选择性）极性作用力（偶极、极性作用力（

35、偶极、氢键）氢键）极性溶质极性溶质保留时间随极性增保留时间随极性增大而增大大而增大小或难保留小或难保留非极性溶质非极性溶质小或难保留小或难保留可保留，保留时间可保留，保留时间随极性减少而增大随极性减少而增大4、高效液相色谱法第84页/共99页2.液固色谱法液固色谱法(1)分离原理以固体吸附剂为固定相、液体为流动相的液相色谱法。由于溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常数的不同导致不同溶质得以分离。4、高效液相色谱法第85页/共99页l 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 原理：吸附+分配，蒹小孔

36、凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物（2）固定相l 极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物4、高效液相色谱法第86页/共99页l硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。l可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂（3 3）流动相4、高效液相色谱法第87页/共99页(4)应用应用中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等不同极性取代基的化合物结构异构体和几何异构体混合物的分离4、高效液相色谱法第88页/共99页3.离子交换色谱法和离子色谱法离子交换

37、色谱法和离子色谱法4、高效液相色谱法(1）分离机理试样离子与离子交换树脂上的离子发生反应：阳离子交换：R-SO3-H+M+=R-SO3-M+H+阴离子交换：R-NR3+Cl-+X-=R-NR3+X-+Cl-不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。第89页/共99页（2）固定相离子交换树脂，根据功能基分为强酸型（磺酸基团）强碱型（季铵基）弱酸型（羧酸）弱碱型（伯、仲、叔胺）4、高效液相色谱法第90页/共99页（3）流动相双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。单柱非抑制型：

38、分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等4、高效液相色谱法第91页/共99页（4）应用）应用分析无机阴离子的首选方法还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。4、高效液相色谱法第92页/共99页4.体积排阻色谱法（体积排阻色谱法（SEC）小分子扩散到凝胶空隙中，出峰最慢；中等分子通过部分凝胶空隙，中速通过；大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，最后出峰。4、高效液相色谱法(1)分离原理以多孔凝胶为固定相，利用凝胶的孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。可分离相对分子质量在100-105范围内的化合物，分离分子大小差要大于10%。第

39、93页/共99页分离原理示意图4、高效液相色谱法第94页/共99页4、高效液相色谱法使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定(2)分类第95页/共99页（3）固定相）固定相软质凝胶：如交联葡聚糖等，水相分离生化体系，适于低、中压操作半刚性凝胶：较高交联度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有机相洗脱，可承受10Mpa的压力硬质凝胶：高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法4、高效液相色谱法第96页/共99页（4）流动相）流动相改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选择原则是：溶解样品、与凝胶浸润、与检测器匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液4、高效液相色谱法第97页/共99页（5）应用）应用大分子的分离分析聚合物分子量分布的测定4、高效液相色谱法第98页/共99页感谢您的观看！第99页/共99页