α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测.pptx

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1、会计学1淀粉淀粉(dinfn)酶的固定化及淀粉酶的固定化及淀粉(dinfn)水解作用的检测水解作用的检测第一页，共20页。酶作为生物催化剂酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性具有专一性和高效性.现在被大量使现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。然而，在应用酶的过程中，用在食品、化工、医药等领域。然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些实际问题：人们也发现了一些实际问题：（1 1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易件非常敏感，容易(rngy)(rngy)失活；失活；（2 2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回收，提高了

2、生）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。产成本，也可能影响产品质量。怎样怎样(znyng)解决这些问题呢？解决这些问题呢？固定化酶技术固定化酶技术(jsh)第1页/共20页第二页，共20页。一、酶与固定化酶一、酶与固定化酶n n酶酶n n固定化酶固定化酶(固相酶固相酶)活细胞活细胞(xbo)产生的具有生物催化产生的具有生物催化作用的生物大分子。作用的生物大分子。将水溶性的酶用物理或化学的方将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质法固定在某种介质(jizh)上，上，使之成为不溶于水而又有酶活性使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。的制剂。第2页/共20页第

3、三页，共20页。固定化酶的优点固定化酶的优点固定化酶的优点固定化酶的优点(yudi(yudi n)n)n n（1 1）使酶固定化后有一定的机械）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反应的过程可管道化、强度，催化反应的过程可管道化、连续化和自动化；连续化和自动化；n n（2 2）酶不溶解在催化反应的溶液）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化中，产物更易纯化(chn hu)(chn hu)；n n（3 3）固定化酶可反复使用，更经）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产；济，更利于工厂化生产；n n（4 4）固定化酶提高了酶的稳定性，）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间贮存和使用；可较长

4、时间贮存和使用；固定化酶的不足之处固定化酶的不足之处(b z zh ch)不能催化一系列反应不能催化一系列反应第3页/共20页第四页，共20页。二、酶的固定化二、酶的固定化n n机理：机理：n n 将固定化酶装柱，当底物将固定化酶装柱，当底物(d w)经过该柱时，在酶的作经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。用下转变为产物。方法方法(fngf)：吸附法吸附法包埋法包埋法共价偶联法共价偶联法交联法交联法目的目的(md)：水溶性酶不溶于水且有酶活性水溶性酶不溶于水且有酶活性物理、化学方法物理、化学方法第4页/共20页第五页，共20页。(一一)、吸附法、吸附法 吸附法是将酶与吸附剂吸附法是将酶与吸附剂

5、接触，再经洗涤除去未吸附的酶接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单便能制得固定化酶。是最简单(jindn)(jindn)的固定化技术，在经济的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。上也最具有吸引力。1、根据、根据(gnj)吸附剂的特点分为两种：吸附剂的特点分为两种：物理物理(wl)吸附法吸附法离子结合法离子结合法通过氢键、疏水键等作用力将通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于酶吸附于固体吸附剂固体吸附剂的方的方法法.如有机硅胶、活性炭和石英如有机硅胶、活性炭和石英砂等砂等利用酶的两性基团和离子交利用酶的两性基团和离子交换剂的相互作用（离子键）。换剂的相互作用（离子键）。吸附量大吸附量

6、大第5页/共20页第六页，共20页。（二）、包埋法（二）、包埋法 将酶包埋在多孔的载体将酶包埋在多孔的载体将酶包埋在多孔的载体将酶包埋在多孔的载体(zit)(zit)(zit)(zit)中，包埋成中，包埋成中，包埋成中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型格子型或包埋成微胶囊型格子型或包埋成微胶囊型格子型或包埋成微胶囊型第6页/共20页第七页，共20页。是目前研究是目前研究(ynji)中最为活跃的中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白的一些方法。它的原理是酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体共基团，在温和的条件下与载体共价结合，形成共价键，从而被固价结合，形成共价键，从而被固定化。定化。（三）共价（三）

7、共价(n ji)偶联法偶联法第7页/共20页第八页，共20页。是酶分子和多功能试剂之间形成是酶分子和多功能试剂之间形成(xngchng)共价键及酶蛋白的氨共价键及酶蛋白的氨基相连得到三维的交联网状结构基相连得到三维的交联网状结构（四）、交联法（四）、交联法氨基氨基(nj)相连处相连处第8页/共20页第九页，共20页。酶酶物理物理(wl)吸吸附法附法交联法交联法包埋法包埋法酶的固定化方法酶的固定化方法(fngf)第9页/共20页第十页，共20页。固定化酶的性质固定化酶的性质(xngzh)n n稳定性增加稳定性增加(zngji)：n n对热、蛋白酶及各种试剂的稳对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。定性

8、。pH活性曲线和最适活性曲线和最适pH的变化的变化(binhu)：可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定底物的专一性变化：底物的专一性变化：第10页/共20页第十一页，共20页。三、三、三、三、-淀粉淀粉淀粉淀粉(dinfn)(dinfn)(dinfn)(dinfn)酶的固定化及酶的固定化及酶的固定化及酶的固定化及淀粉淀粉淀粉淀粉(dinfn)(dinfn)(dinfn)(dinfn)水解作用检测的实验水解作用检测的实验水解作用检测的实验水解作用检测的实验1 1、实验、实验、实验、实验(shyn)(shyn)目的：目的：目的：目的：（1 1）制备固定化）制备固

9、定化）制备固定化）制备固定化-淀粉酶；淀粉酶；淀粉酶；淀粉酶；（2 2）进行淀粉水解的测定。）进行淀粉水解的测定。）进行淀粉水解的测定。）进行淀粉水解的测定。2、实验原理：、实验原理：用吸附法将用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液（用淀粉指示剂溶液（KII2）测试）测试(csh)，流出物呈，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。红色，表明水解产物糊精生成。枯草杆菌的枯草杆菌的-淀粉酶：淀粉酶：最适最适pH5.5pH5.57.57.5最适温度最适温度5

10、5557575淀粉淀粉糊精糊精麦芽糖麦芽糖葡萄糖葡萄糖-淀粉酶淀粉酶-淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶糖化淀粉酶遇碘显蓝色遇碘显蓝色 遇碘显红色遇碘显红色 遇碘不显色遇碘不显色第11页/共20页第十二页，共20页。3 3、设备及用品：、设备及用品：、设备及用品：、设备及用品：5ml 5ml塑料注射器、塑料注射器、塑料注射器、塑料注射器、50ml50ml烧杯、滴管烧杯、滴管烧杯、滴管烧杯、滴管(d(d u u n)n)、自行车用、自行车用、自行车用、自行车用气门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管气门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管气门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管气门芯及夹子、注射器架、试管或

11、微量离心管3 3支支支支4、实验、实验(shyn)材料及其制备材料及其制备（1）-淀粉酶的固定化：淀粉酶的固定化：（2）可溶性淀粉溶液：）可溶性淀粉溶液：（3）5mmol/L KI-I2溶液溶液5mg-5mg-淀粉酶淀粉酶+4ml+4ml蒸馏水蒸馏水+5g+5g石英砂，搅拌石英砂，搅拌(jiobn)(jiobn)，30min 30min 装入层析柱装入层析柱1010倍体积的蒸馏水倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流速为洗涤此注射器，流速为1ml/min1ml/min（约（约2020滴）滴）50mg50mg可溶性淀粉溶于可溶性淀粉溶于100ml100ml热水中，搅拌均匀。热水中，搅拌均匀。0.127g

12、0.127g碘碘+0.83g+0.83g碘化钾碘化钾+蒸馏水蒸馏水100ml,100ml,完全溶解后装入完全溶解后装入滴瓶中。滴瓶中。第12页/共20页第十三页，共20页。5、实验(shyn)步骤：将注射器固定将注射器固定(gdng)在注射器架在注射器架上上用滴管滴加淀粉溶液用滴管滴加淀粉溶液(rngy)，流速，流速0.3ml/min，（尽量慢），（尽量慢）流出流出5ml后接收后接收0.5ml（约（约10滴）流出液滴）流出液加入加入12滴滴KI-I2溶液，观察颜色溶液，观察颜色用水稀释用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较）倍后再观察颜色（与对照组比较）实验后，实验后，10倍柱体积蒸馏水洗涤此

13、柱，放置在倍柱体积蒸馏水洗涤此柱，放置在4冰箱中冰箱中几天后重复实验，观察结果几天后重复实验，观察结果第13页/共20页第十四页，共20页。n n淀粉溶液淀粉溶液+指指示剂：示剂：n n亲和层析洗脱亲和层析洗脱液液+指示剂：指示剂：n n贮于冰箱贮于冰箱(bngxing)(bngxing)几天后重复实几天后重复实验：验：6、实验(shyn)结果：呈蓝色呈蓝色呈红色呈红色(hngs)呈红色呈红色第14页/共20页第十五页，共20页。固定化酶的用途固定化酶的用途固定化酶的用途固定化酶的用途(yngt)(yngt)(yngt)(yngt)在工业上的应用：在工业上的应用：柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦；柚

14、苷酶固定化酶用于果汁脱苦；木瓜木瓜(m u)(m u)蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清；蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清；葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。在化学分析和临床诊断上的应用在化学分析和临床诊断上的应用(yngyng)(yngyng)：用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。在在医药医药上的应用：上的应用：将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹泻，缺少

15、乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。第15页/共20页第十六页，共20页。1 1 1 1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出、试验中为什么要待固定化酶柱中流出、试验中为什么要待固定化酶柱中流出、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml5ml5ml5ml液体液体液体液体(yt)(yt)(yt)(yt)后后后后再接收流出液用于鉴定？再接收流出液用于鉴定？再接收流出液用于鉴定？再接收流出液用于鉴定？讨论讨论(toln)答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要一定

16、的时间一定的时间(shjin)(shjin)，刚开始流出的液体中由于反应，刚开始流出的液体中由于反应时间时间(shjin)(shjin)过短，糊精未生成或生成的量太少，所过短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的颜色鉴定。以不利于后面的颜色鉴定。第16页/共20页第十七页，共20页。2 2 2 2、如何证明洗涤、如何证明洗涤、如何证明洗涤、如何证明洗涤(xd)(xd)(xd)(xd)固定化淀粉酶柱的流出液固定化淀粉酶柱的流出液固定化淀粉酶柱的流出液固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶？中没有淀粉酶？中没有淀粉酶？中没有淀粉酶？答案：可在试管中加入答案：可在试管中加入1ml1ml可溶性淀粉溶

17、液可溶性淀粉溶液(rngy)(rngy)，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加温度，几分钟后加入试管增加温度，几分钟后加入1 1滴滴KI-I2KI-I2指示剂，指示剂，如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液(rngy)(rngy)，使其自柱中流出，作用的结果才能表明，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的结果。是淀粉酶的固相酶作用的结果。第17页/共20页第十八页，共20页。3 3 3 3、耐高温的淀粉酶有

18、哪些可能、耐高温的淀粉酶有哪些可能、耐高温的淀粉酶有哪些可能、耐高温的淀粉酶有哪些可能(knng)(knng)(knng)(knng)的用途？的用途？的用途？的用途？答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越好，答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越好，这就要提高反应温度。通常这就要提高反应温度。通常(tngchng)(tngchng)生产上淀生产上淀粉酶是一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶粉酶是一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。变性失活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下

19、使淀粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀粉酶用途广泛。粉酶用途广泛。第18页/共20页第十九页，共20页。1 1、pHpH：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。从而影响酶吸附。2 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。

20、、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3.3.蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至增加，吸附量也增加，直至增加，吸附量也增加，直至增加，吸附量也增加，直至(zhzh)(zhzh)饱和。饱和。饱和。饱和。4.4.温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5.5.吸附速度：

21、蛋白质在固体载体上的吸附速度要比吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。小分子慢得多。小分子慢得多。小分子慢得多。6.6.载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。强。强。强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。大小。大小。大小。2.影响影响(yngxing)酶在载体（吸附剂）上吸附程度酶在载体（吸附剂）上吸附程度的因素的因素:第19页/共20页第二十页，共20页。