实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目蛋白质.pptx
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1、会计学1实验七亲和层析纯化和实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目鉴定目蛋白质蛋白质实验目的实验目的n n掌握掌握掌握掌握GSTGST亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法(第一部分)和实验方法(第一部分)和实验方法(第一部分)和实验方法(第一部分)n n掌握掌握掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方检测目的蛋白原理和方法(第二部分)法(第二部分)法(第二部分)法(第二部分)第1页/共38页第一部分第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋亲和层析纯化目的蛋白白第
2、2页/共38页亲和层析原理亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共生物大分子与配体特异非共价结合。价结合。n n酶酶-底物或底物类似物(竞争性底物或底物类似物(竞争性抑制剂)抑制剂)n n抗体抗体-抗原抗原n n激素激素-受体受体n n外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细多糖、糖蛋白、细胞表面受体胞表面受体n n核酸核酸-互补序列(互补序列(Oligo-dT)第3页/共38页亲亲和和层层析析原原理理第4页/共38页第5页/共38页第6页/共38页GSH-Sepharose 4B第7页/共38页GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B第8页/共38页GSH-Sepharo
3、se 4BGSH-Sepharose 4B第9页/共38页亲和层析流程亲和层析流程第10页/共38页第一部分第一部分 实验步骤实验步骤第11页/共38页一、细胞破碎一、细胞破碎一、细胞破碎一、细胞破碎n n3600 mL诱导的菌液,离心分装诱导的菌液,离心分装到到12只只50 mL离心管,离心管,-20保存;保存;(每个班用(每个班用2管)管)n n每管加每管加30 mL PBS缓冲液,混匀;缓冲液,混匀;n n超声超声3S,暂停,暂停5S,持续,持续15 min;n n4,10000 rpm,离心,离心10 min;n n取取50 uL上清,作为纯化前的样品;上清,作为纯化前的样品;n n每
4、组取每组取3-5 mL上清液,上柱纯化。上清液,上柱纯化。第12页/共38页二、装二、装二、装二、装GSH-Sepharose 4BGSH-Sepharose 4B柱柱柱柱1.清洗和装好层析柱,封闭出口;清洗和装好层析柱,封闭出口;2.加入加入2 mL PBS;3.取取1-2 mL GSH-Sepharose 4B,加入柱子中;加入柱子中;4.打开柱子出口,使打开柱子出口,使PBS缓慢流缓慢流出。出。注意:始终保持柱内的液面高于注意:始终保持柱内的液面高于注意:始终保持柱内的液面高于注意:始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B GSH-Sepharose 4B 第13页/共3
5、8页三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白三、纯化目的蛋白1.1.用用用用5 mL PBS5 mL PBS缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复3 3遍。遍。遍。遍。2.2.将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液将混合蛋白质溶液2-3 mL2-3 mL加到柱子中。加到柱子中。加到柱子中。加到柱子中。3.3.用用用用5 mL PBS5 mL PBS缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复3 3遍。遍。遍。遍。4.4.加入加入加入加入1.0 mL 1.0 mL 洗脱液。洗脱液。洗脱液。洗脱液。5.5.用用用用1.
6、5 mL1.5 mL离心管收集洗脱液,每管收集离心管收集洗脱液,每管收集离心管收集洗脱液,每管收集离心管收集洗脱液,每管收集 0.2 mL0.2 mL(3-43-4滴),共收集滴),共收集滴),共收集滴),共收集5 5管。管。管。管。6.6.用用用用5 mL PBS 5 mL PBS 缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子3 3遍,关闭出口。遍,关闭出口。遍,关闭出口。遍,关闭出口。7.SDS-PAGE7.SDS-PAGE检测第检测第检测第检测第2 2和和和和3 3管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。管中的目的蛋白。第14页/共38页四、四、四、四、SDS-PAGESDS
7、-PAGE样品制备样品制备样品制备样品制备1号:过柱前的蛋白溶液号:过柱前的蛋白溶液80 uL2号:收集的蛋白溶液(号:收集的蛋白溶液(2号管)号管)80 uL3号:收集的蛋白溶液(号:收集的蛋白溶液(3号管)号管)80 uL 1-3号分别加入号分别加入20 uL 5上上样缓冲液,混匀后在沸水中样缓冲液,混匀后在沸水中加热加热3 min。第15页/共38页 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加样品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16页/共38页亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂n nPBS(pH 7.4):NaCl(58.5)40 g;K
8、Cl(74.5)1.0 g;KH2PO4(136.09)1.2 g;Na2HPO412H2O(358.14)18.1 g;加水定容到加水定容到5000 mL。第17页/共38页亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂亲和层析试剂n n50 mM Tris-HCl(pH 8.0):Tris(121.14)6.055 g,溶于,溶于900 mL水,用水,用HCl调调pH到到8.0,用水,用水定容至定容至1000 mL。n n洗脱液洗脱液:还原型谷胱甘肽(还原型谷胱甘肽(307.32)0.15366 g,溶于溶于50 mL 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)中。中。第18页/共38页第二部分第
9、二部分SDS-PAGE检测目的蛋白质检测目的蛋白质第19页/共38页实验目的实验目的n n掌握掌握掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法检测蛋白原理和方法n n掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法掌握垂直板电泳的实验方法第20页/共38页n n蛋白质与蛋白质与SDS按按1:1.4比例形成复比例形成复合物,消除了各种蛋白质分子之合物,消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。间原有的电荷差异。n n蛋白质的迁移速度只取决于分子蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。大小。n n在在15-200 KD之间,蛋白质的
10、迁之间,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系:移率和分子量的对数呈线性关系:logMW=K-bm实验原理实验原理第21页/共38页第22页/共38页 连续系统:连续系统:连续系统:连续系统:电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液电泳体系中缓冲液pHpH值及凝胶浓值及凝胶浓值及凝胶浓值及凝胶浓度相同。度相同。度相同。度相同。(电荷效应、分子筛效应)(电荷效应、分子筛效应)(电荷效应、分子筛效应)(电荷效应、分子筛效应)不连续系统:不连续系统:不连续系统:不连续系统:缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pH、凝胶浓、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。度及电位梯度的不连续性。(电荷效应、分子筛效
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- 关 键 词:
- 实验 亲和 层析 纯化 SDSPAGE 鉴定 蛋白质
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