气相色谱法分离条件的选择优秀课件.ppt

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1、气相色谱法分离条件的选择第1页，本讲稿共71页 a b ca:柱效项，b:柱选择性项，c:柱容量项2.分离方程式反映分离度与柱效(n),分配系数比()及容量因子(k)的关系式。理论塔板数第二组分的容量因子分配系数比第2页，本讲稿共71页K、n、对色谱峰的影响增加k,分离度增加，峰明显变宽；增加 n,峰变窄，但改善分离度；增加，增加分离度，峰宽度不变。第3页，本讲稿共71页二、实验条件的选择在气相色谱中，固定液、柱温及载气的选择是分离条件选择的3个主要方面。用于提高柱效，降低板高，提高相邻组分的分离度。在进行定量分析时，要求组分能分离完全(R1.5)，才能获得较好的精密度和准确度。1.从分离方程

2、式选择实验条件：第4页，本讲稿共71页（一）提高决定于试样中各组分本身的性质，以及固定相和流动相。越大，固定液的选择性越好，R越大。=1，R=0，两组分不可能分离。提高的方法：1）改变固定相和流动相的组成和性质；2）降低柱温第5页，本讲稿共71页(二)提高k:k大，R大。k与固定液的用量和分配系数有关，并受柱温的影响。增加固定液的用量，可增大R，但会延长分析时间，引起色谱峰展宽。提高k的措施：通过改变柱温和流动相组成，将k值控制为210。第6页，本讲稿共71页(三)提高nn 、L 、H ,R 措施：1）制备一根性能优良的柱子；2）改变流动相的流速和粘度、吸附在载体上的液膜厚度减小H,增大R。第

3、7页，本讲稿共71页2.载气及其流速的选择范氏方程：H=A+B/u+Cua.分子扩散项为主；采用分子量大的载气如N2，Ar,减小扩散系数，提高柱效。第8页，本讲稿共71页范氏方程：H=A+B/u+Cub.传质阻力项为主；选用分子量较小的气体，如H2，He,使组分有较大的扩散系数，提高柱效。通常：u最佳实用u最佳选择载气还应与检测器相匹配。第9页，本讲稿共71页3.柱温的选择 柱温是一个重要参数，直接影响分离效能和分析速度。柱温升高的影响：1）提高分析速度，缩短分析时间；2）使气液传质速率加快，可降低塔板高度，改善柱效。3）高于固定液“最高使用温度”，会造成柱流失。4)加剧纵向扩散，降低柱效。优

4、优点点缺缺点点第10页，本讲稿共71页降低柱温的影响：1）增大分配系数，增加柱选择性；2）降低气相扩散，减少固定液流失；3）延长柱寿命，降低检测本底。缺点：1）增加分析时间；2）液相传质阻抗增加，峰扩张，严重时引起拖尾。第11页，本讲稿共71页3、柱温的选择、柱温的选择选择柱温的原则选择柱温的原则：在使难分离的物质得到良好的分离、分析时间适宜、并且峰形不拖尾的前提下，尽可能采用低柱温。对于宽沸程的混合物，采取程序升温 通常根据试样的沸点选择柱温、固定液用量及载体的种类。第12页，本讲稿共71页 表表 根据试样沸点选择柱温等条件根据试样沸点选择柱温等条件试样沸点范围 柱温 固定液用量 载体种类气

5、体、气态烃气体、气态烃 室温室温100 2030：100 红色红色 低沸点试样低沸点试样100200 150 1020：100 红色红色200300 150180 510：100 白色白色300450 200250 15：100 白色、玻璃白色、玻璃注：固定液用量为固定液：载体第13页，本讲稿共71页 程序升温：指按预先设定的加热速度对色谱柱分期加热以使混合物中所有的组分均能在最佳温度下获得良好的分离。程序升温可以是线性的，也可以是非线性的。第14页，本讲稿共71页图a,恒定柱温Tc=45,图b,恒定柱温，但Tc=120图c：为程序升温。例:程序升温与恒定柱温分离沸程为225的烷烃与卤代烃9个

6、组分的混合物的差别。第15页，本讲稿共71页4、柱长和内径的选择、柱长和内径的选择分离度正比于柱长的平方根，即所以增加柱长对分离有利。但增加柱长会使各组分的保留时间增加，延长分析时间。因此，在满足一定分离度的条件下，应尽可能使用较短的柱子。填充柱柱长24m.第16页，本讲稿共71页3、柱长和内径的选择、柱长和内径的选择增加色谱柱的内径，可以增加分离的样品量，但纵向扩散路径的增加，会使柱效降低。柱内径46mm.第17页，本讲稿共71页4、进样时间和进样量、进样时间和进样量进样时间：进样速度必须很快，因为当进样时间太长时，试样原始宽度将变大，色谱峰半峰宽随之变宽，有时甚至使峰变形。一般地，进样时间

7、应在1s以内。第18页，本讲稿共71页进样量进样量：每根柱子，都有最大允许进样量。进样量过大，会造成色谱柱超负荷，柱效下降，峰形变宽，保留时间改变。最大允许进样量，应控制在使峰面积和峰高与进样量呈线性关系的范围内，液体试样一般进样0.10.2l。第19页，本讲稿共71页五、其它条件五、其它条件气化室温度：气化室温度应等于或稍高于样品的沸点，以保证迅速气化。通常高于柱温3050，否则色谱峰展宽，峰高下降。汽化室温度过高，会导致样品分解第20页，本讲稿共71页检测器温度：检测器温度：高于柱温30-50或等于气化室温度TCD：高于柱温，温度升高灵敏度下降，温度应稳定FID：100以上，对温度要求不高

8、ECD：温度对基流和峰高影响很大，但应具体样品具体分析第21页，本讲稿共71页三、样品预处理对于一些挥发性或热稳定性很差的物质，需进行预处理，才能用于分离分析。1.分解法2.衍生化法：酯化法，硅烷化法第22页，本讲稿共71页一、毛细管气相色谱法的特点和分类(一)毛细管气相色谱法的特点1.分离效能高。2.柱渗透性好（载气流动阻力小）3.柱容量小，允许进样量小。一般采用分流进样技术和柱后尾吹。4.易实现气相色谱-质谱联用。5.总柱效高。6.应用范围广。第五节 毛细管气相色谱法 第23页，本讲稿共71页毛细管柱的内径一般小于1mm,可分为开管型和填充型；常规、小内径、大内径毛细管柱等。1.填充型毛细

9、管柱 填充毛细管柱：先在玻璃管内松散地 装入载体，拉成毛细管再涂固定液。微型填充柱:柱径细,载体颗粒细到几 十到几百微米。(二)毛细管柱的分类第24页，本讲稿共71页2.开管型毛细管柱按内壁的状态分：(1)涂壁毛细管柱(wall coated open tubular column,WCOT):固定液涂在毛细管内壁上。(2)多孔层毛细管柱(porous-layer open tubular column,PLOT):在毛细管内壁上附着一层多孔固体，沉积在毛细管玻璃内表面而制成的。第25页，本讲稿共71页(3)涂载体开管柱(support coated open tubular column,S

10、COT):先在毛细管内壁上粘附一层载体，在此载体上再涂以固定液。第26页，本讲稿共71页按内径分：(1)常规毛细管柱：内径0.10.3mm,一般0.25mm左右，可以是玻璃毛细管柱，或弹性石英毛细管柱(fused silica open tubular column,FSOT柱)，又称熔融氧化硅开管柱。(2)小内径毛细管柱(microbore column):内径小于100m,一般为50m的弹性石英毛细管。(3)大内径毛细管柱：柱内径一般为0.32mm,0.53mm,常用石英柱.第27页，本讲稿共71页详细表达式：二、毛细管色谱速率理论和实验 条件的选择(一)毛细管色谱速率理论方程Golay

11、方程式 H=B/u+Cgu+Clu第28页，本讲稿共71页 空心毛细管柱，A=0，Cg:气相传质项在毛细管柱速率理论方程中较为重要。纵向扩散项随载气线速增加而下降。为了降低气相传质项的斜率，增加Dg,常采用高扩散系数和低黏度的氢气作载气。第29页，本讲稿共71页(二)毛细管色谱操作条件的选择1.毛细管柱的直径2.载气的选择3.液膜厚度第30页，本讲稿共71页1.毛细管柱的直径H与柱内径平方r2成正比，uopt与柱内径成反比。内径以100300m为宜。快速分析采用细内径、短 毛细管柱进行。第31页，本讲稿共71页2.载气的选择常用的载气：N2,H2,He.根据Golay曲线，多用氢气作载气。第3

12、2页，本讲稿共71页3.液膜厚度液膜厚度增加会使塔板高度增加，柱效下降。为了快速分析，常用小柱内径和薄液膜柱，为了增大柱容量，采用大口径和厚液膜柱。第33页，本讲稿共71页三、毛细管气相色谱三、毛细管气相色谱结构流程结构流程进样部分有用载气分流放空的控制流路和为检测器提供柱后尾吹气的流路系统第34页，本讲稿共71页(一)进样系统毛细管柱与填充柱的比较 毛细管柱 填充柱内径 1mm 46mm流速 1ml/min 30ml/min柱外死体积 影响峰展宽 不影响峰展宽由于死体积影响毛细管柱的峰展宽，柱后要用尾吹流路系统，进样用分流装置，采用分流进样方式。第35页，本讲稿共71页1.分流进样分流进样：

13、进样后，气化室中载气流量较大，气化后，将混合物中较小的部分送进柱子，大部分放空。如气化室总流速100ml/min,柱流速1ml/min,进样时间为1/100 min。作用：(1)快速进样，起始谱带窄。(2)控制样品进入色谱柱的量，保证毛细管柱不超载。第36页，本讲稿共71页2.分流进样器和分流比分流进样器：使用玻璃内插套管作为进样器的气化室，分流进样使用24mm的玻璃套管，同时打开分流进样阀。分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样量之比。一般在50：1到500：1之间调节。第37页，本讲稿共71页分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术。第38页，

14、本讲稿共71页3.线性分流样品组分经过分流器分出的一小部分的量进入柱子，它能够代表样品中组分的含量，对一个设计合理的分流器，样品中的每一组分都能准确地分流成相同的比例，而与组分的化学性质、沸点差异以及浓度大小等因素无关。第39页，本讲稿共71页 第六节第六节 定性与定量分析定性与定量分析一、定性分析方法目的：确定待测试样的组成，判断各色谱峰代表什么组分。优点：分离分析多种组分的混合物缺点：未知物定性困难，需用已知纯物质或有关的色谱定性参数定性。第40页，本讲稿共71页常用定性方法1.已知物对照法2.利用相对保留值3.利用保留指数(retention index)定性4.官能团分类测定法5.两谱

15、联用定性第41页，本讲稿共71页1.已知物对照法方法：将已知物和未知物在相同的色谱柱上，以相同的操作条件进行实验，将两张色谱图进行比较，保留时间相同，试样可能含有此已知物组分。第42页，本讲稿共71页复杂样品定性已知物增加峰高法：将已知物加到未知试样中混合进样，若待定性组分峰比不加已知物时的峰高相对增加了，则可能含有该已知物的成分。双柱定性：在两个性质差别较大的柱子上该色谱峰峰高都增大，一般可认定是同一物质。第43页，本讲稿共71页2.利用相对保留值定性对于组分简单的已知范围的混合物，在无已知物的情况下，采用此法。通过引入参比物质，计算相对保留值，克服色谱条件变化导致的定性错误r1,2的数值决

16、定于组分的性质、柱温与固定液的性质，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况等无关。第44页，本讲稿共71页方法：查手册 根据手册的实验条件及所用的标准物进行实验 取规定的标准物加入被测样品中混匀，进样，求r1,2 与手册数据对比定性第45页，本讲稿共71页3.利用保留指数定性 利用手册上的保留指数对物质进行定性，保持固定液及柱温相同。保留指数的重复性及准确性均较好(相对误差1%),是定性的重要方法。方法：估计未知物为哪类物质 查手册 根据手册给出的色谱条件进行实验 计算保留指数 与手册数据对照定性第46页，本讲稿共71页4.官能团分类测定法把色谱柱的流出物(欲鉴定的组分)，通进官能团分类试剂中，

17、观察试剂是否反应(颜色变化或产生沉淀)，判断该组分含什么官能团或属于哪类化合物。再参考保留值，便可粗略定性。第47页，本讲稿共71页5.两谱联用定性气相色谱作为分离手段，质谱、红外光谱作为鉴定工具。GC-MS，GC-FTIRSampleSampleSampleSample 589058901.0 1.0 DEG/MIDEG/MIN NHEWLETTHEWLETTPACKARDPACKARDHEWLETHEWLETT T PACKARPACKARD D5972A5972AMass Mass Selective Selective DetectorDetectorD DC CB BA A A A

18、A AB B B BC C C CD D D DGasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)MassSpectrometer(MS)SeparationSeparationIdentificationIdentificationB B B BA A A AC C C CD D D D第48页，本讲稿共71页二、定量分析方法二、定量分析方法1、色谱定量的依据：当操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号(峰面积或峰高)成正比。mi=fi Ai fi为校正因子，与检测器及被测组分性质有关第49页，本讲稿

19、共71页引入定量校正因子的原因引入定量校正因子的原因1.当两个当两个质量相同质量相同的的不同组分不同组分在相同条件下在相同条件下使用使用同一检测器同一检测器进行进行测定测定时，所得的时，所得的峰峰面积却不相同面积却不相同不同物质其不同物质其fi不同不同2.混合物中某一组分的混合物中某一组分的百分含量并不等于百分含量并不等于该组分的该组分的峰面积峰面积在各组分峰面积总和中所在各组分峰面积总和中所占的占的百分率百分率第50页，本讲稿共71页绝对校正因子绝对校正因子(fi)：单位峰面积所代表物质的：单位峰面积所代表物质的质量质量 fi=mi/Ai fi值与组分i质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子

20、。绝对校正因子的局限性：1）精确求出fi值比较困难。2）对fi值没有统一的标准而无法直接应用。第51页，本讲稿共71页相对校正因子相对校正因子fi:物质物质i和标准物质和标准物质s的绝的绝对校正因子之比。对校正因子之比。fi=fi/fs 相对校正因子相对校正因子fi常用常用相对重量校正因子相对重量校正因子fg（fw）来表示。）来表示。第52页，本讲稿共71页相对校正因子的测定方法相对校正因子的测定方法相对校正因子与被测物和标准物以及检测器的类型有关，而与操作条件无关。因此，fi 值可自文献中查出引用。若文献中查不到所需的fi值，也可以自己测定。常用的标准物质，对热导检测器（TCD）是苯，对氢焰

21、检测器（FID）是正庚烷。第53页，本讲稿共71页2 2、定量方法：、定量方法：归一化法归一化法外标法外标法内标法内标法内标校正曲线法内标校正曲线法第54页，本讲稿共71页2 2、定量方法、定量方法归一化法归一化法归一化法通常采用面积归一化法方法优点a.简便、准确，定量结果与进样量无关 b.流速、柱温等操作条件变化对结果影响很小。第55页，本讲稿共71页2 2、定量方法、定量方法归一化法归一化法方法缺点：1)必须所有组分在一个周期内都能流出色谱柱，检测器对它们都能产生信号。2)不能用于微量杂质的含量测定。第56页，本讲稿共71页外标法外标法外标法又称标准曲线法在一定操作条件下，用对照品配成不同

22、浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量(或浓度)作校正曲线，求出斜率、截距，而后计算样品的含量。若校正曲线线性好，截距近似为零，可用外标一点法(比较法)定量。第57页，本讲稿共71页外标一点法：用一种浓度的i组分的标准溶液，进样一次，或同样体积进样多次，取峰面积平均值，样品溶液在相同条件下进样，测得峰面积，用下式计算含量：i组分的质量i组分的峰面积i组分对照液的质量i组分对照液的峰面积第58页，本讲稿共71页方法优点：操作计算简便，不必用校正因子，不必加内标物，常用于日常分析。方法缺点：1）色谱条件（检测器的响应、柱温、流动相的流速（特别是对于气相色谱）、进样量、柱效等）对方法准确

23、度影响极大 2）进样量要求准确第59页，本讲稿共71页内标法内标法方法：方法：选择适宜的选择适宜的纯物质纯物质作为内标物，作为内标物，定量定量加加到准确称取的到准确称取的样品样品中，根据被测组分和内中，根据被测组分和内标物在检测器上的标物在检测器上的响应值之比响应值之比及内标物的及内标物的加入量加入量进行定量，此方法称为内标法。进行定量，此方法称为内标法。mi=fiAi ms=fsAs第60页，本讲稿共71页内标物应满足的条件内标物应满足的条件1.内标物应是试样中不存在的物质2.内标物的性质应尽可能与被测组分性质相近，不与样品发生化学反应并完全溶于样品3.内标物的色谱峰应尽可能位于被测组分的峰

24、附近，或几个被测组分峰中间，并且与这些组分完全分离4.内标物的加入量应与被测组分相近第61页，本讲稿共71页方法优点：1.定量结果准确，不需准确进样；2.只要内标物及被测组分出峰，与其他组分是否出峰无关；3.适用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量。方法缺点：样品配制麻烦，不易寻找内标物。第62页，本讲稿共71页内标校正曲线法内标校正曲线法特殊的内标法以被测组分的纯物质作为内标物的内标法。方法 配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物；配制试样液，加入相同量的内标物，进样分析，测Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图，求出斜率、截距后，计算试样的浓度。第63页，本讲稿共71页内标对

25、比法 内标校正曲线法的截距近似为零，可用内标对比法(已知浓度试样对照法)定量：第64页，本讲稿共71页方法优点：不必测出校正因子，消除了某些操作条件的影响，不需严格准确体积进样。方法缺点：要进行两次色谱操作，必须保证两次测定的校正因子相同，否则会导致测定误差第65页，本讲稿共71页三、应用及实例气相色谱法在药物分析中的应用很广泛，包括药物的含量测定、杂质检查、有机溶剂的残留量、中药成分研究、制剂分析、治疗药物监测和药物代谢研究等。第66页，本讲稿共71页1.药物有机溶剂残留量测定 药物中有机溶剂残留量测定在药典中可用不同的方法表述：一为有机溶剂残留量限度列在质量标准品种项下，如秋水仙碱中的氯仿

26、和醋酸乙酯；二为药典中列出一个应限制残留溶剂的总表。第67页，本讲稿共71页表 有机溶剂残留量限量(110-6)有机溶剂 中国药典 美国药典 欧洲药典 苯 2 2 100 氯仿 60 60 50二氧六环 380 380 100二氯甲烷 600 600 500 吡啶 200 100 甲苯 890环氧乙烷 10三氯乙烯 80 100 乙腈 50第68页，本讲稿共71页2.药品的含量测定例 维生素E含量测定(中国药典2000年版二部)色谱条件与系统适应性试验：以硅酮(OV-17)为固定液，涂布浓度为2%，柱温为265。理论塔板数按维生素E峰计算应不低于500，维生素E峰与内标峰的分离度应大于2。(1)校正因子测定 取正三十二烷适量，加正己烷溶解并稀释成每1ml中含1.0mg第69页，本讲稿共71页的溶液，摇匀，作为内标溶液。另取维生素E对照品约20mg,精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液10ml，密塞，振摇使溶解，取13l注入气相色谱仪，测定，计算，即得。(2)维生素E片、注射液、胶丸及粉剂均用上述气相色谱法测定。第70页，本讲稿共71页3.有关物质检查气相色谱法除了用于药品含量测定外，还可用于有关物质测定，如克罗米通顺式异构体的测定，采用PEG-20M，涂布厚度为0.25m,30m长，柱温180，规定含顺式异构体不得超过顺、反式异构体之和的15%。第71页，本讲稿共71页