《疫学基本知识》PPT课件.ppt

《《疫学基本知识》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《疫学基本知识》PPT课件.ppt（154页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、免疫学基本知识 抗原的概念抗抗原原(antigen(antigen，Ag)Ag)是是指指能能刺刺激激机机体体免免疫疫系系统统诱诱导导免免疫疫应应答答并并能能与与应应答答产产生生的的抗抗体体或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞发发生生特特异异反反应应的的物物质质。一一个个完完整整的的抗抗原原应应包包括括两两方方面面的的免免疫疫性性质质：免免疫疫原原性性(immunogenicity)(immunogenicity)指指诱诱导导宿宿主主产产生生免免疫疫应应答答的的能能力力，具具有有这这种种能力的物质称为免疫原能力的物质称为免疫原(immunogen)(immunogen)；抗原的概念反反应应原原性性(im

2、munoreactivity)(immunoreactivity)指指抗抗原原与与抗抗体体或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞发发生生特特异异性性结结合合的的能能力力，亦亦称称为为反反应应原原性性。有有些些物物质质在在独独立立存存在在时时只只具具有有反反应应原原性性而而无无免免疫疫原原性性，称称为为半半抗抗原原(hapten)(hapten)；而而免免疫疫原原通通常常同同时时具具有有免免疫疫反应能力。反应能力。抗体的概念n n抗抗抗抗原原原原刺刺刺刺激激激激机机机机体体体体，产产产产生生生生免免免免疫疫疫疫学学学学反反反反应应应应，由由由由机机机机体体体体的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞合合合合成成成

3、成并并并并分分分分泌泌泌泌的的的的与与与与抗抗抗抗原原原原有有有有特特特特异异异异性性性性结结结结合合合合能能能能力力力力的的的的一一一一组组组组球球球球蛋蛋蛋蛋白白白白，这这这这就就就就是是是是免免免免疫疫疫疫球球球球蛋蛋蛋蛋白白白白，这这这这种种种种与与与与抗抗抗抗原原原原有有有有 特特特特 异异异异 性性性性 结结结结 合合合合 能能能能 力力力力 的的的的 免免免免 疫疫疫疫 球球球球 蛋蛋蛋蛋 白白白白(immunoglobulin(immunoglobulin(immunoglobulin(immunoglobulin，Ig)Ig)Ig)Ig)就是抗体。就是抗体。就是抗体。就是抗体

4、。n nIgIgIgIg由由由由浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生，存存存存在在在在于于于于血血血血液液液液和和和和其其其其他他他他体体体体液液液液（包包包包括括括括组组组组织织织织液液液液和和和和外外外外分分分分泌泌泌泌液液液液）中中中中，约约约约占占占占血血血血浆浆浆浆蛋蛋蛋蛋白白白白总总总总量量量量的的的的20202020；还可分布在；还可分布在；还可分布在；还可分布在B B B B细胞表面。细胞表面。细胞表面。细胞表面。抗体的概念n n抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个原决定簇刺激机体，由一个B B淋巴细胞

5、接受该抗原淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为所产生的抗体称之为单克隆抗体（单克隆抗体（Monclone Monclone antibodyantibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是体混杂在一起就是多克隆抗体多克隆抗体，机体内所产生的，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA、

6、IgEIgE和和IgDIgD等五类抗体。等五类抗体。免疫应答免免疫疫应应答答（immuneresponseimmuneresponse）是是机机体体免免疫疫系系统统对对抗抗原原刺刺激激所所产产生生的的以以排排除除抗抗原原为为目目的的的的生生理理过过程程。这这个个过过程程是是免免疫疫系系统统各各部部分分生生理理功功能能的的综综合合体体现现，包包括括了了抗抗原原递递呈呈、淋淋巴巴细细胞胞活活化化、免免疫疫分分子子形形成成及免疫效应发生等一系列的生理反应。及免疫效应发生等一系列的生理反应。免疫应答 通过有效的免疫应答，机体得以维护内环境的稳定免疫应答的基本过程 抗原识别阶段抗原识别阶段（antige

7、n-recogniting phase）是抗原通过某一途径进入机体，并被）是抗原通过某一途径进入机体，并被免疫细胞识别、递呈和诱导细胞活化的开始免疫细胞识别、递呈和诱导细胞活化的开始时期，又称感应阶段。一般，抗原进入机体时期，又称感应阶段。一般，抗原进入机体后，首先被局部的单核巨噬细胞或其他辅后，首先被局部的单核巨噬细胞或其他辅佐细胞吞噬和处理，然后以有效的方式（与佐细胞吞噬和处理，然后以有效的方式（与MHCMHC类分子结合）递呈给类分子结合）递呈给T TH H细胞。细胞。(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE）

8、免疫应答的基本过程 B B细细胞胞可可以以利利用用其其表表面面的的免免疫疫球球蛋蛋白白分分子子直直接接与与抗抗原原结结合合，并并且且可可将将抗抗原原递递呈呈给给T TH H细细胞胞。T T细细胞胞与与B B细细胞胞可可以以识识别别不不同同种种类类的的抗抗原原，所所以以不不同同的的抗抗原原可可以以选选择择性性地地诱诱导导细细胞胞免免疫疫应应答答或或抗抗体体免免疫疫应应答答，或或者者同同时时诱诱导导两两种类型的免疫应答。种类型的免疫应答。（TO BE CONTINUETO BE CONTINUE）免疫应答的基本过程 另另一一方方面面，一一种种抗抗原原颗颗粒粒或或分分子子片片段段可可能能含含有有多多

9、种种抗抗原原表表位位，因因此此可可被被不不同同克克隆隆的的细细胞胞所所识识别别，诱诱导多种导多种特异性的免疫应答特异性的免疫应答。(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE(TO BE CONTINUE）免疫应答的类型按参与细胞分类：按参与细胞分类：根根据据主主导导免免疫疫应应答答的的活活性性细细胞胞类类型型，可可分分为为细细胞胞介介导导免免疫疫和和体体液液免免疫疫两两大大类类。T T细细胞胞介介导导的的免免疫疫应应答答，简简称称为为细细胞胞免免疫疫，体体液液免免疫疫是是B B细细胞胞介介导导的的免免疫疫应应答答，也也可可称称抗抗体体应答，以血清

10、中出现循环抗体为特征。应答，以血清中出现循环抗体为特征。（TO BE CONTINUETO BE CONTINUE）免疫应答的类型按抗原刺激顺序分类：按抗原刺激顺序分类：某某抗抗原原初初次次刺刺激激机机体体与与一一定定时时期期内内再再次次或或多多次次刺刺激激机机体体可可产产生生不不同同的的应应答答效效果果。据据此此可可分分为为初初次次应应答答和和再再次次应应答答两两类类。一一般般地地说说，不不论论是是细细胞胞免免疫疫还还是是体体液液免免疫疫，初初次次应应答比较缓慢柔和，再次应答则较快速激烈。答比较缓慢柔和，再次应答则较快速激烈。（TO BE CONTINUETO BE CONTINUE）免疫应

11、答的类型按应答效果分类按应答效果分类按应答效果分类按应答效果分类：一一一一般般般般情情情情况况况况下下下下，免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答的的的的结结结结果果果果是是是是产产产产生生生生免免免免疫疫疫疫分分分分子子子子或或或或效效效效应应应应细细细细胞胞胞胞，具具具具有有有有抗抗抗抗感感感感染染染染、抗抗抗抗肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤等等等等对对对对机机机机体体体体有有有有利利利利的的的的效效效效果果果果，称称称称为为为为免免免免疫疫疫疫保保保保护护护护；但但但但在在在在另另另另一一一一些些些些条条条条件件件件下下下下，过过过过度度度度或或或或不不不不适适适适宜宜宜宜的的的的免免免免疫疫疫疫应应应应答

12、答答答也也也也可可可可导导导导致致致致病病病病理理理理损损损损伤伤伤伤，称称称称为为为为超超超超敏敏敏敏反反反反应应应应，包包包包括括括括对对对对自自自自身身身身抗抗抗抗原原原原应应应应答答答答产产产产生生生生的的的的自自自自身身身身免免免免疫疫疫疫病病病病。与与与与此此此此相相相相反反反反，特特特特定定定定条条条条件件件件下下下下的的的的免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答可可可可不不不不表表表表现出任何明显效应，称为现出任何明显效应，称为现出任何明显效应，称为现出任何明显效应，称为免疫耐受免疫耐受免疫耐受免疫耐受。（TO BE CONTINUETO BE CONTINUETO BE CONTI

13、NUETO BE CONTINUE）免疫应答的类型 另外，在免疫系统另外，在免疫系统发育不全发育不全时，可时，可表现出某一方面或全面的表现出某一方面或全面的免疫缺陷免疫缺陷；而；而免疫系统的免疫系统的病理性增生病理性增生而称为而称为免疫增殖免疫增殖病。病。免疫应答间的关系免疫学技术免疫学技术抗原抗体反应抗原抗体反应n n 抗原抗体反应抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)(antigen-antibody reaction)是指抗原与是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（体内（invivoinvivo

14、），也可发生于体外），也可发生于体外(invitro)(invitro)。体内反应。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现可出现凝集凝集反应、反应、沉淀沉淀反应、反应、补体参与补体参与的反应及的反应及中中和和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，血清中，在抗原或抗

15、体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（serologicreactionserologicreaction）。）。第一节抗原抗体反应的原理第一节抗原抗体反应的原理pp抗原抗体反应可分为两个阶段。抗原抗体反应可分为两个阶段。pp第一第一为抗原与抗体发生为抗原与抗体发生特异性结合特异性结合的阶段，此阶段反的阶段，此阶段反应应快快，仅需，仅需几秒至几分钟几秒至几分钟，但，但不不出现出现可见可见反应。反应。pp第二为第二为可见可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、（如电解质、pHpH、温度、补体）

16、的影响下，进一步交、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应等肉眼可见的反应。此阶段反应慢慢，往往，往往需要需要数分钟数分钟至至数小时数小时。pp实际上这两个阶段难以严格区分，而且两阶段的反应实际上这两个阶段难以严格区分，而且两阶段的反应所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开始时抗原抗体浓度较大且两者比较适合，则很快能形始时抗原抗体浓度较大且两者比较适合，则很快能形成可见反应。成可见反应。第二节抗原抗体反应的特点

17、（一）特异性（一）特异性（一）特异性（一）特异性抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以和空间构型上呈互补关系，所以和空间构型上呈互补关系，所以和空间构型上呈互补关系，所以抗原与抗体的结抗原与抗体的结抗原与抗体的结抗原与抗体的结合具有高度的特异性合具有高度的特异性合具有高度的

18、特异性合具有高度的特异性。这种特异性如同钥匙和锁。这种特异性如同钥匙和锁。这种特异性如同钥匙和锁。这种特异性如同钥匙和锁的关系。的关系。的关系。的关系。例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。能与破伤风外毒素结合。能与破伤风外毒素结合。能与破伤风外毒素结合。较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同

19、的抗原表位，或抗原、种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现抗体间构型部分相同，皆可出现抗体间构型部分相同，皆可出现抗体间构型部分相同，皆可出现交叉交叉交叉交叉反应。反应。反应。反应。（二）按比例n n在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子

20、比例合适时才出现体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的反应。最强的反应。n n以沉淀反应为例，若向一排试管中中入一定量的以沉淀反应为例，若向一排试管中中入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线关系可绘制出反应曲线（图（图1 1）。）。图图1 1沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系AgAg：抗原；：抗原；AbAb：抗体：抗体n n从图中可见，曲线的高峰部分是抗原抗体分子比从图中可见，曲线的高峰部

21、分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalencezoneofequivalence）。在此范围内，抗原抗体充）。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。其中有一管反应最分结合，沉淀物形成快而多。其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比（适，称为最适比（optimalratiooptimalratio）。）。n n在等价带前后分别为抗体过剩则无沉淀物形

22、成，这种现象称为带现象（zonephenomenon）。出现在抗体过量时，称为前带（prezone），出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）。n n在用沉淀反应对不同来源的抗血清进行比较后，在用沉淀反应对不同来源的抗血清进行比较后，发现抗体可按等价带范围大小分为两种类型，即发现抗体可按等价带范围大小分为两种类型，即R R型抗体和型抗体和H H型抗体。型抗体。R R型抗体以家兔免疫血清为代型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血

23、均属此型。物的免疫血均属此型。H H型抗体以马免疫血清为型抗体以马免疫血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和许多大动物的抗血清皆属许多大动物的抗血清皆属H H型。型。（三）可逆性n n抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为：n nAb-AgAb.Ag=k1/k2=kn n式中各反应项的单位以mol表示，k1表示反应速度常数，k2为逆反应速度常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可知，K值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以K值表

24、示。（三）可逆性n n抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力；二是环境因素对复合物的影响。n n反之，低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结构、活性及特异性。（三）可逆性n n在环境因素中，凡是减弱或消除抗原抗体亲和力在环境因素中，凡是减弱或消除抗原抗体亲和力的因素都会使逆向反应加快，复合物解离增加。的因素都会使逆向反应加快，复合物解离增加。如如pHpH改变，过高或过低的改变，过高或过低的pHpH值均可破坏离子间电值均可破坏离子间电引力消失。对亲合力本身较弱的反应体系而言，引力消失。对亲合力本身较弱的反应体系而言，仅增加离子强度

25、即可解离抗原抗体复合物的目的；仅增加离子强度即可解离抗原抗体复合物的目的；增加温度可增加分子间的热动能，加速已结合的增加温度可增加分子间的热动能，加速已结合的复合物的解离，但由于温度变化易致蛋白变性，复合物的解离，但由于温度变化易致蛋白变性，所以实际工作中极少应用。改变所以实际工作中极少应用。改变pHpH和离子强度是和离子强度是最常用的促解离方法，免疫技术中的亲和层析就最常用的促解离方法，免疫技术中的亲和层析就是以此为根据纯化抗原或抗体。是以此为根据纯化抗原或抗体。影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素n n（一）电解质（一）电解质n n抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变抗原与抗

26、体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用用0.850.85氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+Na+和和C1C1，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（势下降。当电势降至临界电势（121215mV15mV）以下）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，

27、形时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。成可见的沉淀物或凝集物。影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素n n（二）酸碱度n n抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为68进行。pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。（三）温度（三）温度n n在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于抗体碰

28、撞机会增多，使反应加速。但若温度高于5656时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在性或破坏；在4040时，结合速度慢，但结合牢固，时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为3737。每每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在在4 4 左右与红细胞结合最好，左右与红细胞结合最好，2020以上反而解离。以上反而解离。n n此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。速反应。沉淀反应沉淀

29、反应n n沉淀反应是指可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen），可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素（precipitin）。第一节液体内沉淀试验第一节液体内沉淀试验n n一、絮状沉淀试验 将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。（一）抗原稀释法（一）抗原稀释法n n将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或3

30、7反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。n n（二）抗体稀释法（Ramon）法n n用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应 n n二、环状沉淀试验第二节凝胶内沉淀试验第二节凝胶内沉淀试验n n用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。一、单向扩散试验一、单向扩散试验n n是在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。n n可分为试管法和平板法两种（二）平板法（二）平板法n n是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：n n将抗体或抗

31、血清混入将抗体或抗血清混入0.90.9琼脂糖内（约琼脂糖内（约5050），未），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般直径约直径约3 35mm5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或），孔中加入抗原溶液，放室温或3737让其向四周扩散，让其向四周扩散，242448h48h后可见周围出现沉淀后可见周围出现沉淀环环 n n由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散疫扩散 n n单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差（

32、不能测性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差（不能测g/mlg/ml以下含量）。以下含量）。二、双向扩散试验二、双向扩散试验n n在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。免疫电泳技术免疫电泳技术n n免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析 n n一、免疫电泳n n二、对流免疫电泳n n三、火箭免疫电泳n n四、免疫固定电泳n

33、n经典的沉淀试验有4个缺点无法克服，即操作繁琐、敏感度低（10100g/ml）、时间长和难以自动化。凝集反应凝集反应n n凝集作用（反应）（agglutination）:特异性抗体引起抗原颗粒凝集或形成块状的作用（反应）。n n凝集素（agglutinin）:凝集素即凝集抗体。在凝集反应中与颗粒性抗原起反应的抗体。n n凝集原（agglutinogen）:在凝集反应中，刺激凝集素产生或与抗体反应的抗原，这种抗原通常是颗粒性抗原。凝集反应的特点凝集反应的特点n n凝集反应的发生分两阶段：pp抗原抗体的特异结合；pp出现可见的颗粒凝集。n n凝集试验是一个定性的检测方法，也可以进行半定量检测，n

34、n凝集试验灵敏度高，方法简便。凝集反应凝集反应n n凝集反应可分为n n直接凝集反应；n n间接凝集反应；n n自身红细胞凝集试验n n抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应是两种特殊的凝集反应 第二节直接凝集反应第二节直接凝集反应n n细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应（direct agglutination）。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。（一）玻片凝集试验（一）玻片凝集试验n n玻片凝集试验为定性试验方法，一般用已知抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集

35、结果，出现颗粒凝集的为阳性反应。n n此法简便、快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型。玻片法还用于红细胞ABO血型的鉴定。（二）试管凝集试验（二）试管凝集试验n n为半定量试验方法，为半定量试验方法，n n常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度。价，亦称为滴度。n n在试验中，由于电解质浓度和在试验中，由于电解质浓度和pHpH不适当等原因，可不

36、适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。必须设不加抗体的稀释液作对照组。n n常用的直接试管凝集试验为肥达试验（常用的直接试管凝集试验为肥达试验（Widal Widal testtest）和外斐试验（）和外斐试验（Weil-Felix testWeil-Felix test）。）。第三节间接凝集反应第三节间接凝集反应n n将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应（indirectaggluti

37、nation）或被动凝集反应（passiveagglutination）。n n其敏感度高于沉淀反应 一、间接凝集反应的类型一、间接凝集反应的类型n n1 1（正向）间接凝集反应用抗原致敏载体以（正向）间接凝集反应用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体：检测标本中的相应抗体：（正向）间接凝集反应原理示意图（正向）间接凝集反应原理示意图（正向）间接凝集反应原理示意图（正向）间接凝集反应原理示意图2反向间接凝集反应反向间接凝集反应n n用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。抗原。反向间接凝集反应原理示意图反向间接凝集反应原理示意图3间接凝集抑制反应间接凝集

38、抑制反应n n诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。n n检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。被抑制。n n可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为

39、诊断试剂，可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体，此时称反向间接凝集抑制反以检测标本中的抗体，此时称反向间接凝集抑制反应。应。间接凝集抑制反应原理示意图A：标本中含抗原B：标本中不含抗原4协同凝集反应协同凝集反应n n协同凝集反应（coaggoltination）与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白（staphylococcusprotienA，SPA）。SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。n n协同凝集反应也适用

40、于细菌的直接检测。中和反应n n细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应 (neutralization)(neutralization)中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体，中和病毒感染抗体反应试验方法，用以测定抗体，中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结合，使性或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。能与细菌外毒其失去感染力的抗体又称中和

41、抗体。能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和试验可以在敏感动物体内试验可以在敏感动物体内(包括鸡胚包括鸡胚)，体外组织，体外组织(细细胞胞)培养或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易培养或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应或中和毒素对细胞的毒作用；以及测定抗体的其他或中和毒素对细胞的毒作用；以及测定抗体的其他生物学效应。生物学效应。免疫标记技术免疫标记技术n n经典的三大标记技术：荧光抗体技术、放射免疫分析和酶免疫技术。n n首先被用作标记免疫

42、技术中标记物的是荧光素；n n放射性核素作为标记物在免疫技术中的应用又开创了特异性的超微量测定；n n酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果。酶免疫技术酶免疫技术n n这种标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位，属于免疫组化技术（immunohisto chemical technique）范畴，n n另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。称为免疫测定（immunoassay）。ELISA的原理和类型的原理和类型n n基本原理：n n1971年Engvall和Perlman

43、n发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的基本原理的基本原理n n使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。n n使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA的基本原理的基本原理n n在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反

44、应。n n用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。标本中受检物质的量成一定的比例。n n加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。n n由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应

45、效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISAn n有3种必要的试剂：n n固相的抗原或抗体，n n酶标记的抗原或抗体，n n酶作用的底物。（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法检测抗原最常用的方法检测抗原最常用的方法（二）双位点一步法（二）双位点一步法n n在双抗体夹心法测定抗原时，如应用在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的的单克隆抗体单克隆抗体分别作为固相抗体和酶分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入和酶标抗体的加入两步并作一步两步

46、并作一步简化简化了操作，缩短了反应时间，了操作，缩短了反应时间，n n它应用高亲和力的单克隆抗体，测定它应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。的敏感性和特异性也显著提高。钩状效应钩状效应n n一步法测定中，应注意一步法测定中，应注意钩状效应钩状效应（hook hook effecteffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际

47、含量。钩状效应严重时甚至可将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现出现假阴性假阴性结果。结果。（三）间接法测抗体是检测抗体最常用的方法是检测抗体最常用的方法（四）竞争法（四）竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体可用于测定抗原，也可用于测定抗体（五）捕获法测（五）捕获法测IgM抗体抗体n n血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。ELISA的技术要点的技术要点pp（一）固相载体（一）固相载体pp最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后

48、保留原白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。来的免疫活性。pp聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。pp最常用的载体为微量反应板，最常用的载体为微量反应板，pp国际通用的标准板形是国际通用的标准板形是812812的的9696孔式。为便于作少孔式。为便于作少量标本的检测，有制成量标本的检测，有制成8 8联或联或1212联孔条的，放入座架联孔条的，放入座架后，大小与标准后，大小与标准ELISAELISA板相同。板相同。ELISA的的固相载体固相载体rr好的好的ELISAELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度板应该是吸附性能好，空白值低，孔底

49、透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。rr每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人检查方法为：以一定浓度的人IgGIgG（一般为（一般为10ng/ml10ng/ml）包被）包被ELISAELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgGIgG抗抗人人IgGIgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在别测每孔溶液的吸光度。控制反应条

50、件，使各读数在0.80.8左左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于差应小于1010。rr与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISAELISA固相载体，固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。不如聚苯乙烯板。（二）抗原和抗体（二）抗原和抗体rr要求：抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。rr抗原有三个来源：pp天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化。pp重组抗原（re