药品生产企业微生物实验室质量控制课件.ppt

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1、 药品生产企业 微生物实验室的质量控制 内容n微生物实验室规范的控制n微生物检验方法的控制 相关法规要求nGMP(2010年修订版)n中国药典2010版药品微生物实验室规范指导原则n中国药典2010版微生物限度检查法n中国药典2010版无菌检查法n中国药典2010版微生物限度检查法应用指导原则n中国药典2010版药品微生物检验替代方法验证指导原则 应用范围 n药品生产所使用的原料及制剂都必须遵守法规要求n药品生产及销售都必须符合法律要求。n微生物质量的标准可能会因地域及应用方式的不同而不同。n各国药典中都有相应微生物试验的详细要求。原则 n必须使用经验证的检验方法n严格按照药品微生物试验室规范

2、要求进 行试验(实验室控制系统GMP实施指南）2010版GMPn第六十四条n第六十六条n第六十九条n第二百二十六条n第二百三十三条 药品微生物实验室规范药品微生物实验室规范包括以下几个方面：n人员n培养基n菌种n实验室的布局和运行n设备、文件、实验记录，结果的判断等 人员n人员资质n培训要求实验室的布局和运行n具有良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。n既要最大可能防止微生物的污染，又要 防止检验过程对环境和人员造成危害。n合适的规划及活动区域的合理区分将提 高微生物实验室操作的可靠性。实验室的布局n检验洁净区n菌种处理、微生物鉴别、阳性对照实验室（P2实验室）n培养室n实验结果观察区n

3、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区n样品接收和储藏区n标准菌株储藏区n污染物处理区n文档处理区等辅助区域 实验室的运行n人流n物流n水系统n洁净装修n实验室管理：环境监测、清洁消毒、制度及标准操作规程的制定 实验室的布局和运行n总结 设备n实验室应配备与检验能力和工作量相适应的的仪器设备。n完成相应的检定，校准，验证，确认。n形成相应的操作，维护和保养的标准操 作规程。n使用要有记录。设备n无菌隔离器（如使用）、生物安全柜 n实验室用层流台 n培养箱 n蒸汽灭菌柜、干热灭菌柜n空调高效过滤器n其他n灭菌消毒方式 设备n 重要的仪器设备，应由专人负责n 对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅对关键参数（如

4、温度、压力）和记录（有条件的情况下尽量使用自动记录装置），如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。设备n 容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进 行清洁和消毒。n 对试验需用的无菌器具应有明确标识，实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相 应的标准操作规程。培养基n培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。n适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质 量控制试验是提供优质培养基的保证。培养基n培养基的制备n培养基的储藏n质量控制实验 菌种n n 微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感 的，因为它们的生物活

5、性和特性依赖于合适的的，因为它们的生物活性和特性依赖于合适的 试验操作和贮藏条件。试验操作和贮藏条件。n n 实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使 尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统 一操作程序制备菌株是微生物试验结果一致性一操作程序制备菌株是微生物试验结果一致性 的重要保证。的重要保证。n n 试验菌种应是从国家菌种中心获得的标准菌试验菌种应是从国家菌种中心获得的标准菌 种，经过实验室复活并在适宜的培养基中生长种，经过实验室复活并在适宜的培养基中生长 后保存。后保存。菌种保藏机构菌种保藏机构 中国菌种保

6、藏管理委员会中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）成立于1979年。下设7个菌种保藏管理中心及有关专业实验室，共12个单位实行统一领导，按专业分工管理。n n普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）n n中国科学院微生物研究所n n中国科学院武汉病毒研究所n n农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）n n中国农业科学院土壤肥料研究所n n医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）n n中国医学科学院皮肤病研究所n n中国药品生物制品检定所n n中国预防医学科学院病毒研究所n n工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）n n中国食品发酵工业科学研究所n n抗生素菌种保藏管理中心（CACC）n n中国医学

7、科学院医用生物技术研究所 n n四川抗生素研究所四川抗生素研究所n n华北制药厂抗生素研究所华北制药厂抗生素研究所n n兽医微生物菌种保藏管理中心（兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCCCVCC）n n农业部兽医药品监察所农业部兽医药品监察所n n林业微生物菌种保藏管理中心（林业微生物菌种保藏管理中心（CFCCCFCC）n n中国林业科学院中国林业科学院n n专利微生物菌种保藏管理中心（专利微生物菌种保藏管理中心（ACCCACCC）n n武汉大学武汉大学 国外的菌种保藏机构国外的菌种保藏机构n n世界菌种保藏联合会（WFCC）n n美国标准菌种收藏所（ATCC）n n美国农业部北部地区研究实验室

8、（NRRL）n n英国 国立标准菌种收藏所（NCTC）n n英国 国际真菌研究所（CMI）n n荷兰真菌中心保藏所（CBS）n n日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）菌种n标准菌株的复活n培养物的制备n工作菌株的传代次数n菌种的管理文件及记录菌种的管理n n 1 1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作 的的条件和设备。条件和设备。菌种应由专人负责管理，管理人员应具菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。心。n n 2 2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理

9、制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。n n 3 3、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。应有专用的冰箱，应上锁管理。n n 4 4、由专人按操作规程和有关要求定期进、由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般行传代，

10、并定期对保存的菌种进行检查，一般每年每年1 12 2次，（或定期更换冻干菌种）。发现次，（或定期更换冻干菌种）。发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。长期保存时。n n 5、菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴定等均应做好详细记录。n n 6、菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。文件n 文件应当充分表明实验是在实验室按可 控的检查法进行的 文件n 人员培训和资格确

11、认n设备验收；验证；检定（或校准期间核查）和维修n设备使用中的运行状态（设备的关键参数）n培养基制备、储存和质量控制n检验规程中的关键步骤n数据记录与结果计算的确认n质量责任人对实验报告的评估n数据偏离的调查文件n 每一个进行检验的实验室必须建立并遵 守质量保证（QA）的政策和程序，用所 建立的QA政策和程序来监测和评价整个 检验过程。n 所有QA活动都必须文件化。实验记录n实验结果的可靠性依赖于实验严格按照标准操作规程进行。n标准操作规程应指出如何进行正确的实验操作。n实验记录应包含所有关键的实验细节，以便确认数据的完整性。实验记录n正确的试验研究和实验记录是微生物试验成功的关键。要使实验结

12、果可信最基本的原则是试验应按SOP规定的内容进行操作；如正确的试验操作、完整的实验记录，以便确认数据的完整性。结果的判断n微生物实验的特殊性n影响结果观察的条件和因素n不符合要求和规定的原因调查n异常结果的分析n重新抽样复检微生物实验的特殊性影响试验结果的因素 药品微生物检验较为特殊，因是活微生物，受到外界影响因素较，因此检验结果分析比较困难，其影响因素有以下几方面：1、微生物在自然界中普遍存在。2、实验人员在样品处理过程或其它操作步骤可能受微生物污染。3、微生物在样品或环境中分布不均匀等。异常结果分析 以上原因造成试验结果的误差大和重现性差，因此，在试验时应尽最大程度的避免外来的污染。应对实

13、验结果进行全面分析，如果实验结果不符合标准规定，应立即通知实验室管理人员，组织进行原因调查分析。分析内容包括：实验室环境 抽样区的防护条件 样品本身是否具有影响微生物存活或繁殖的成分和作用 实验操作是否规范 以上都是评价实验结果真实性的重要依据。n如果依据分析调查结果发现，试验全过程中任何一个环节有错误，可判实验结果无效，那么应重新制定实验方案，按照正确的方案进行实验，在这种情况下，应特别认真对试验过程及正确的试验操作进行监控，实验室必须认可复试程序，如果需要，重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查，这种情况必须详细记录。微生物限度检查法n细菌数n霉菌数、酵母菌数n控制菌n检查方

14、法的验证n微生物限度标准n结果判断 无菌检查法微生物限度检查法应用指导原则n对微生物限度检查法中的标准、方法中 的特定内容、标准的应用做进一步的说 明。n 10项内容药品微生物检验替代方法验证指导原则n为微生物实验室所采用的试验方法能否替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导n微生物定性检验方法的验证n微生物定量检验方法的验证 三类微生物检验的新技术n 基于微生物生长信息的检验技术，如生物发 光技术、电化学技术、比浊法等；n 直接测定被测介质中活微生物的检验技术如 固相细胞计数法、流式细胞计数法等；n 基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析 技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分

15、析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时，新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。若替代方法只是针对药典方法的某一环节进行技术修改，则验证仅针对该替代技术而非整个检验方法。药品微生物检验方法分为定性试验和定量试验。定性试验是测定样品中是否存在活的微生物；定

16、量试验是测定样品中存在的微生物数量。替代方法的验证也分为定性和定量两类，不同类型需要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见下表。参数定性检验定量检验准确度精密度专属性检测限定量限线性范围重现性耐用性注：表示需要验证 表示不需要验证替代方法的一般要求n 在以替代方法对样品检验的适用性进行验证前，必须证明所选用的替代方法具有方法适用性，即表明在不含样品的情况下，替代方法的专属性、精密度、检测限等参数。n 确认方法的适用性后，用样品按上表规定的参数进行验证。验证至少用2个批号的样品，每批样品每个菌应至少平行进行三次独立实验。n 参数验证的菌种应

17、包括培养基适用性检查规定的菌种，必要时，还应根据替代方法及样品的特性增加相应的菌种。定性检验的方法验证 1、专属性：是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。强调应关注样品存在对检验结果的影响 在使用依赖培养技术（以微生物生长作为判断）的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性，应特别确认培养基的促生长试验及样品的存在对检验结果的影响。对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性，应特别确认检测系统中的外来成分不得干扰试验，确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。2、检测限：是指在替代方法设定

18、的检验条件 下，样品中能被检出的微生物的最低数量，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。验证的关键是确定接种菌的最低数量（每单位不超过5cfu），分别用药典方法和替代方法对该菌进行检验，比较两种方法的差异。与国外药典规定相同，要求试验菌的接种量应能够在采用药典方法检验时，有50的检出率。检测限验证至少应重复进行5次。3、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限

19、以上，评价验证结果时，应排除样品均一性的影响 4、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点。在开展了上述评价后，可以不必比较替代方法的耐用性与药典方法的差异。定量检验的方法验证 1、准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度的确认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率（）来表示准确度。验证的菌浓度应该在检测范围内，一般应选择能够准确计数的最高浓度，系列稀释至较低浓度，并且至少应该有5种浓度，每种浓度重复检验5次。替代方法的回收率应该达到70以上。当替代方法并不依赖

20、微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况，此时应结合专属性的内容对准确性进行评价。2、精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度。通常采用标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。验证的菌浓度同准确度，每种浓度重复检验10次。可以接受的相对标准偏差（RSD）应不大于35。一般来说，替代方法的相对标准偏差（RSD）应不大于药典方法。在该项目上，USP 的规定是1535，研究表明，当含菌浓度在30300cfu/ml时，计数结果的RSD完全可能在15以内，因此，指导原则中对该指标作了修改。3、专属性：是指通过检测适宜的试验菌，以

21、证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。验证的关键是合理评价样品的存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时，这种评价显得尤为必要。4、定量限：是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。5、线性：是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确检

22、测的所有浓度范围。每株菌至少应该有5种浓度，每种浓度至少测定5次。在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为因变量，进行线性回归分析，计算相关系数，替代方法的相关系数不得低于0.95。6、范围：是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。7、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时应制备均一的实验样本 8、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。当检验方法采用基于培养的技术时，一般的参数变化是指对培养温度和时间进行调整，上述调整对检验结果的影响并不显著。谢谢！