结构与性能课程学习.pptx

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1、会计学1结构结构(jigu)与性能与性能第一页，共48页。蛋白质的一级结构：就是氨基酸残基的排列顺序以及蛋白质的一级结构：就是氨基酸残基的排列顺序以及蛋白质的一级结构：就是氨基酸残基的排列顺序以及蛋白质的一级结构：就是氨基酸残基的排列顺序以及(yj)(yj)二硫键（如果存在）的位置。理论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。二硫键（如果存在）的位置。理论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。二硫键（如果存在）的位置。理论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。二硫键（如果存在）的位置。理论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。测定氨基酸顺序的意义：氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的

2、分子基础氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系的分析，更揭露了控制多肽链折叠(zhdi)的一些规律如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可能导致其功能异常和疾病氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史第1页/共48页第二页，共48页。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构(jigu)(jigu)(jigu)(jigu)的测定的测定的测定的测定n n样品必需样品必需(bx)(bx)纯（纯（97%97%以上）；以上）；n n知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；n n知道蛋白质由几个亚基组成；知道蛋白质由几个亚基组成；n n测定蛋白质的氨基酸组

3、成；并根据分子量计测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。算每种氨基酸的个数。n n测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。1 1、测定、测定(cdng)(cdng)蛋白质的一级结构的要蛋白质的一级结构的要求求第2页/共48页第三页，共48页。测定方法很多，如总氮量法，福林酚试剂法，双缩脲法，紫外吸收法等。近来已有专用的蛋白质分析仪，但经典的凯氏定氮法仍是食品，饲料分析，种子鉴定及营养和生化研究中最广泛应用且具有足够精度(jnd)的方法。蛋白质含量(hnling)测定：第3页/共48页第四页，共48页。蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、

4、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他(qt)一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50氢7氧23氮16%硫03其他(qt)微量第4页/共48页第五页，共48页。可可以以将将生生物物组组织织的的含含氮氮量量近近似似地地看看作作蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量。由由于于大大多多数数蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量接接近近于于16%16%，所所以以，可可以以根根据据生生物物样样品品中中的的含含氮氮量量来来计计算算蛋蛋白质的大概白质的大概(dgi)(dgi)含量。含量。蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；

5、缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数(xsh)，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质）。三聚氰胺（化学式：C3H6N6）第5页/共48页第六页，共48页。实验(shyn)原理:有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，消化(xiohu)生成（NH4）2SO4反应式为：H2SO4=SO2+H2O+OR.3NH32+mH2O2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放(shfng)出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:2NH4+OH

6、-=NH3+H2ONH3+H3BO3=NH4+H2BO3-再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，即得蛋白质的含量反应式为：H2BO3-+H+=H3BO3第6页/共48页第七页，共48页。2 2 2 2、测定、测定、测定、测定(cdng)(cdng)(cdng)(cdng)步骤步骤步骤步骤第7页/共48页第八页，共48页。(1)(1)多肽链的拆分：多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须(bx)(bx)先进行拆分。先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，几条多肽链借助非共价键

7、连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链（亚基）。盐酸胍处理，即可分开多肽链（亚基）。第8页/共48页第九页，共48页。(2)(2)二硫键的断裂二硫键的断裂 几几条条多多肽肽链链通通过过二二硫硫键键交交联联在在一一起起。可可在在可可用用8mol/L8mol/L尿尿素素或或6mol/L6mol/L盐盐酸酸胍胍存存在在下下，用用过过量量的的-巯巯基基乙乙醇醇处处理理，使使二二硫硫键键还还原原为为巯巯基基，然然后后用用烷烷基基化化试试剂剂保保护

8、护(boh)(boh)生成的巯基，以防止它重新被氧化。生成的巯基，以防止它重新被氧化。第9页/共48页第十页，共48页。巯基（巯基（巯基（巯基（-SH-SH）的保护）的保护）的保护）的保护(b(b oh)oh)第10页/共48页第十一页，共48页。(3)(3)测定测定(cdng)(cdng)每条多肽链的氨基酸组成，并计算每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比出氨基酸成分的分子比目前各大公司如Beckman，PerkinElmer，Waters等都有各自的自动(zdng)进样、氨基酸分析和定量报告联为一体的商品化氨基酸自动(zdng)分析仪出售。第11页/共48页第十二页，共48页。

9、n nSangerSanger法法法法。2,4-2,4-二二二二硝硝硝硝基基基基氟氟氟氟苯苯苯苯在在在在碱碱碱碱性性性性条条条条件件件件下下下下，能能能能够够够够与与与与肽肽肽肽链链链链N-N-端端端端的的的的游游游游离离离离氨氨氨氨基基基基作作作作用用用用(zuyng)(zuyng)，生成二硝基苯衍生物（，生成二硝基苯衍生物（，生成二硝基苯衍生物（，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。）。）。n n在在在在酸酸酸酸性性性性条条条条件件件件下下下下水水水水解解解解，得得得得到到到到黄黄黄黄色色色色DNP-DNP-氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸。该该该该产产产产物物物物能能能能够够够够用用用用乙乙

10、乙乙醚醚醚醚抽抽抽抽提提提提分分分分离离离离。不不不不同的同的同的同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。(4)分析(fnx)多肽链的N-末端和C-末端末端氨基酸的测定：N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序(shnx)分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFBDNFBDNFB）法）法）法）法第12页/共48页第十三页，共48页。n n在在在在碱碱碱碱性性性性(jin(jin(jin(jin xn)xn)xn)xn)条条条条件件件件下下下

11、下，丹丹丹丹磺磺磺磺酰酰酰酰氯氯氯氯（二二二二甲甲甲甲氨氨氨氨基基基基萘萘萘萘磺磺磺磺酰酰酰酰氯氯氯氯）可可可可以以以以与与与与N-N-N-N-端端端端氨氨氨氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。氨基酸。氨基酸。n n此此此此法法法法的的的的优优优优点点点点是是是是丹丹丹丹磺磺磺磺酰酰酰酰-氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸有有有有很很很很强强强强的的的的荧荧荧荧光光光光性性性性质质质质，检检检检测测测测灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度可可可可以以以以达达达达到到到到1 1 1 1 10-9mol10-9mol

12、10-9mol10-9mol。丹磺酰氯法丹磺酰氯法丹磺酰氯法丹磺酰氯法第13页/共48页第十四页，共48页。n n此法是多肽链此法是多肽链此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基端氨基端氨基端氨基酸即从肽链上解离酸即从肽链上解离酸即从肽链上解离酸即从肽链上解离(ji l)(ji l)出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够出来，其余的氨基

13、酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。端氨基酸分离。端氨基酸分离。肼解法肼解法肼解法肼解法(ji f)(ji f)(ji f)(ji f)第14页/共48页第十五页，共48页。n n氨氨氨氨肽肽肽肽酶酶酶酶是是是是一一一一种种种种肽肽肽肽链链链链外外外外切切切切酶酶酶酶，它它它它能能能能从从从从多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的N-N-N-N-端端端端逐逐逐逐个个个个的的的的向向向向里里里里水水水水解。解。解。解。n n根根根根据据据据(gnj)

14、(gnj)(gnj)(gnj)不不不不同同同同的的的的反反反反应应应应时时时时间间间间测测测测出出出出酶酶酶酶水水水水解解解解所所所所释释释释放放放放出出出出的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸种种种种类类类类和和和和数数数数量量量量，按按按按反反反反应应应应时时时时间间间间和和和和氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基释释释释放放放放量量量量作作作作动动动动力力力力学学学学曲曲曲曲线线线线，从从从从而而而而知道蛋白质的知道蛋白质的知道蛋白质的知道蛋白质的N-N-N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。末端残基顺序。末端残基顺序。n n最最最最常常常常用用用用的的的的氨氨氨氨肽肽肽肽酶酶酶酶是是是是

15、亮亮亮亮氨氨氨氨酸酸酸酸氨氨氨氨肽肽肽肽酶酶酶酶，水水水水解解解解以以以以亮亮亮亮氨氨氨氨酸酸酸酸残残残残基基基基为为为为N-N-N-N-末末末末端端端端的肽键速度最大。的肽键速度最大。的肽键速度最大。的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶法第15页/共48页第十六页，共48页。n n羧羧羧羧肽肽肽肽酶酶酶酶是是是是一一一一种种种种肽肽肽肽链链链链外外外外切切切切酶酶酶酶，它它它它能能能能从从从从多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的C-C-C-C-端端端端逐逐逐逐个个个个的的的的水水水水解解解解。根根根根基基基基不不不不同同同同的的的的反反反反应应应应时时时时间间间间测测测测出出出出酶酶酶

16、酶水水水水解解解解所所所所释释释释放放放放出出出出的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸种种种种类类类类和和和和数数数数量量量量，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的C-C-C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。末端残基顺序。末端残基顺序。n n目目目目前前前前常常常常用用用用(chn(chn(chn(chn yn)yn)yn)yn)的的的的羧羧羧羧肽肽肽肽酶酶酶酶有有有有四四四四种种种种：A,B,CA,B,CA,B,CA,B,C和和和和Y Y Y Y；A A A A和和和和B B B B来来来来自自自自胰脏；胰脏；胰脏；胰脏；C C C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；来自柑桔

17、叶；来自柑桔叶；Y Y Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。来自面包酵母。来自面包酵母。n n羧羧羧羧肽肽肽肽酶酶酶酶A A A A能能能能水水水水解解解解除除除除Pro,ArgPro,ArgPro,ArgPro,Arg和和和和LysLysLysLys以以以以外外外外的的的的所所所所有有有有C-C-C-C-末末末末端端端端氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基；B B B B只能水解只能水解只能水解只能水解ArgArgArgArg和和和和LysLysLysLys为为为为C-C-C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。末端残基的肽键。末端残基的肽键。羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法第16页/共4

18、8页第十七页，共48页。(5)(5)多肽链断裂成多个肽段，可采用多肽链断裂成多个肽段，可采用(ciyng)(ciyng)两种或两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。套肽段或肽碎片，并将其分离开来。酶解法(ji f):胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶第17页/共48页第十八页，共48页。化学法：化学法：(Cyanogen Bromide)(Cyanogen Bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成(xngch

19、ng)(xngchng)的肽键。的肽键。第18页/共48页第十九页，共48页。羟胺裂解法羟胺（NH2OH）在碱性条件下（pH 9.0）能专一性裂解-Asn-Gly-间的肽键，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-间的肽键；在酸性条件可以断裂-Asp-Pro-间的肽键，产率可达80%。部分酸水解 一般认为酸水解没有什么专一性而被忽视，后来发现部分酸水解还是(hi shi)有一定的专一性。在稀酸的条件下，也即在高浓度胍的甲酸中（pH 2.5），可裂解-Asp-Pro-间的肽键，产率高达80%90%。在浓酸条件下，含羟基氨基酸氨基端肽键容易断裂。但是终究部分酸水解的专一性差，副反应多，此

20、法比较难掌握。第19页/共48页第二十页，共48页。EdmanEdman法法（异异硫硫氰氰酸酸苯苯酯酯法法）氨氨基基酸酸顺顺序序分分析析法法实实际际上上也也是是一一种种N-N-端端分分析析法法。此此法法的的特特点点是是能能够够不不断断重重复复循循环环，将将肽肽链链N-N-端端氨基酸残基逐一进行标记氨基酸残基逐一进行标记(bioj)(bioj)和解离。和解离。(6)测定每个肽段的氨基酸顺序(shnx)(自动序列分析仪测序)第20页/共48页第二十一页，共48页。第21页/共48页第二十二页，共48页。(7)(7)确定肽段在多肽链中的次序：确定肽段在多肽链中的次序：利利用用(lyng)(lyng)

21、两两套套或或多多套套肽肽段段的的氨氨基基酸酸顺顺序序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。16肽，N端HC端S法裂解(liji)：QNSPSEQVERLAHQWT法裂解(liji)：SEQWTQNVERLAPSHQ重叠法确定序列：HQWTQNSEQVERLAPS第22页/共48页第二十三页，共48页。(8)(8)确定确定(qudng)(qudng)原多肽链中二硫键的位置原多肽链中二硫键的位置一般采用胃蛋白酶处理没有断开(dunki)二硫键的多肽链；再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析；然后同其它

22、方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。第23页/共48页第二十四页，共48页。蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰蛋蛋白白质质的的化化学学修修饰饰：是是指指在在较较温温和和的的条条件件下下，以以可可控控制制的的方方式式使使蛋蛋白白质质与与某某种种试试剂剂（称称化化学学修修饰饰剂剂）起起特特异异反反应应，以以引引起起蛋蛋白白质质中中个个别别氨氨基基酸酸侧链或功能团发生共价化学改变。侧链或功能团发生共价化学改变。理理想想情情况况下下，修修饰饰试试剂剂只只是是有有选选择择地地与与某某一一特特定定的的残残基基反反应应，很很少少或或几几乎乎不不引引起起蛋蛋白白质质分分子子

23、(fnz)(fnz)的的构构象象变变化化。在在此此基基础础上上，从从该该基基团团的的修修饰饰对对蛋蛋白白质质分分子子(fnz)(fnz)的的生生物物活活性性所所造造成成的的影影响响，就就可可以以推推测测出出被被修修饰饰的残基在该蛋白质分子的残基在该蛋白质分子(fnz)(fnz)中的功能。中的功能。只只有有具具有有极极性性的的氨氨基基酸酸残残基基的的侧侧链链基基团团才才能能够够进进行行化化学学修修饰饰，这这些些基基团的反应性取决于它们的亲核性。团的反应性取决于它们的亲核性。第24页/共48页第二十五页，共48页。1 1 1 1、化学修饰的主要、化学修饰的主要、化学修饰的主要、化学修饰的主要(zh

24、yo)(zhyo)(zhyo)(zhyo)作用作用作用作用(1)探测蛋白质的必需氨基酸残基的性质和数目。蛋白质的化学修饰可以很快地揭示蛋白质分子中哪些侧链基团是表现酶活性所必需的。它可以帮助人们初步认识该蛋白质分子中哪些残基能处于活性部位并为其表现功能所必需。(2)用于蛋白质纯度分析与鉴定。(3)用于蛋白质一级序列的测定。序列分析时，首先必须了解N-末端的残基。多肽链N-末端残基的分析常用的修饰试剂有二硝基氟苯、丹氟酰氯，即二甲基氨基萘磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯(PITC)。PITC也是测定蛋白质序列的Edman降解法的关键试剂。此外，在氨基酸组成分析中的半胱氨酸残基的测定、二硫键的断裂、

25、侧链基团的保护等均采用各种方法的化学修饰。(4)探测蛋白质分子的构象变化和运动性。探测某些基因的暴露程度，以分析蛋白质分子的构象变化，如利用5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定不同去折叠(zhdi)状态的反应巯基数目，可以探测其去折叠(zhdi)的程度，还可以通过监测A412随时间的变化探测去折叠(zhdi)的动力学。(5)利用亲和标记探测活性部位局部区域的构象状态。有些化学试剂可专一性地修饰酶的活性部位的侧链基团，从而在活性部位引入探测基团(如具有荧光性或顺磁性基团)，以探明活性部位的构象状态及构象变化。第25页/共48页第二十六页，共48页。(6)探索蛋白质和酶作用的化学机理。

26、通过化学修饰可以探明哪些侧链基团参与了酶的催化作用，为探明其作用的化学机理和催化历程起了重要的作用，也为药物设计提供了分子基础。(7)利用共价交联技术(jsh)研究蛋白质分子的拓扑学、构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态。(8)利用蛋白质晶体的重金属衍生物(也属于一种化学修饰)，进行X衍射晶体结构分析。(9)用于蛋白质和酶分子的固定化。在蛋白质和酶分子的固定化技术(jsh)中，除部分用物理方法固定外，主要的还是采用化学方法的固定化。其本质是蛋白质和酶的化学修饰，其中包括载体偶联法和共价交联法。这类化学修饰希望只修饰非必需基团，设法避免必需基团的破坏，以保持蛋白质和酶的活性。(10)定向改造

27、蛋白质分子的性质。用基因定点突变技术(jsh)，改变蛋白质主链的化学结构，在蛋白质的肽链结构中删去、替换或增加某些氨基酸残基，以研究其结构与功能的关系，并可定向地进行蛋白质的改造。此外，还可以通过侧链基团的化学修饰，改造蛋白质分子的性质，如使其激活、失活，或使其稳定性提高等。总之蛋白质化学修饰仍然作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础性研究和应用研究。第26页/共48页第二十七页，共48页。（1 1 1 1）酰基化反应）酰基化反应）酰基化反应）酰基化反应(fnyng)(fnyng)(fnyng)(fnyng)试剂试剂(shj)(shj)特点：含有特点：含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使

28、之酰基化。结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（SerSer、ThrThr），酚羟基（），酚羟基（TyrTyr）。）。修饰剂：如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和修饰剂：如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-O-甲基异脲等。甲基异脲等。在室温在室温(20(2025)25)，pH 4.5pH 4.59.09.0的条件下。的条件下。2 2、化学修饰的种类、化学修饰的种类(zhngli)(zhngli)乙酰咪唑OR-C-X第27页/共48页第二十八页，共48页。（2 2 2 2）烷基

29、化反应）烷基化反应）烷基化反应）烷基化反应(fnyng)(fnyng)(fnyng)(fnyng)试试剂剂特特点点：烷烷基基上上带带活活泼泼卤卤素素，导导致致蛋蛋白白质质分分子子的的亲亲核核基基团团（如如NH2NH2，-SH-SH，-COOH-COOH等等）发生发生(fshng)(fshng)烷基化。烷基化。可可作作用用基基团团：氨氨基基（LysLys，ArgArg），巯巯基基（CysCys），羧羧基基（AspAsp、GluGlu），甲甲硫硫基基（MetMet），咪咪唑基（唑基（HisHis）。）。修饰剂：修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。2

30、,4-二硝基(xioj)氟苯碘代乙酸第28页/共48页第二十九页，共48页。（3 3 3 3）氧化）氧化）氧化）氧化(ynghu)(ynghu)(ynghu)(ynghu)和还原反应和还原反应和还原反应和还原反应试剂特点：具有试剂特点：具有(jyu)氧化性或还原性。氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸Trp）、咪唑基，酚）、咪唑基，酚基等。基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团：二硫键。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐

31、氧化连四硫酸盐氧化(ynghu)巯基，巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基还原逆回，用于保护巯基第29页/共48页第三十页，共48页。（4 4 4 4）芳香）芳香）芳香）芳香(fngxing)(fngxing)(fngxing)(fngxing)环取代反应环取代反应环取代反应环取代反应酚羟基在酚羟基在3和和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应(fnyng)试剂：卤（碘）化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：碘代：I2+HI 硝化：硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH（四硝基甲烷）（四硝基甲烷）四硝基甲烷(TNM)作用于酪氨酸的酚羟基，形成3-

32、硝基酪氨酸的衍生物。这种产物(chnw)有特殊的光谱，可用于直接的定量测定。第30页/共48页第三十一页，共48页。（5 5 5 5）蛋白质肽链的裂解）蛋白质肽链的裂解）蛋白质肽链的裂解）蛋白质肽链的裂解(li ji)(li ji)(li ji)(li ji)另外还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应，如溴化氰裂解，在自发(zf)和诱导重排的条件下主要导致肽键的断裂。溴化氰(CNBr)裂解甲硫氨酸残基的羧基侧链肽键的反应机理如下图所示：第31页/共48页第三十二页，共48页。(N-terminal)(N-terminal)MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGT

33、DDDDKAMADIGSSRMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSSRMM Target Target ProteinProtein MMSRVDLKLAAALEHHHHHHSRVDLKLAAALEHHHHHH (C-terminal)(C-terminal)CNBr treatmentCNBr treatment TGRGDSPATGRGDSPA(GVPGV)(GVPGV)2 2GG(GAGAGS)GG(GAGAGS)3 3ASAS n n 重重重重组组组组蛋白蛋白蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)氨基酸序列氨基酸序列氨基酸序列氨基

34、酸序列Target Protein:Target Protein:第32页/共48页第三十三页，共48页。3 3、特定、特定(tdng)(tdng)氨基酸残基侧链基团的化学氨基酸残基侧链基团的化学修饰修饰1)1)氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：来源：来源：Lys,Arg,His,GlnLys,Arg,His,Gln修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：酰基化与烷基化：酰基化与烷基化酰基化修饰剂酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化修饰剂：烷基化修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘

35、乙酰胺、亚硝酸等）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等第33页/共48页第三十四页，共48页。2)2)羧基的化学修饰羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺（常用水溶性碳化二亚胺（EDCEDC）修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子）修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子(fnz)(fnz)中羧基的数目。中羧基的数目。+水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺第34页/共48页第三十五页，共48页。化学(huxu)接枝EDCHCl与丝素蛋白分子侧链上的-COOH发生反应(fnyng)，形成氨基反应(fnyng)活性的O-酰基脲中间体，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的

36、加入将该中间体转化为具有氨基反应(fnyng)活性的NHS酯，它能够与抗菌肽分子（图中p）上的-NH2发生反应(fnyng)，通过酰胺键形成这两种化合物的键合物。第35页/共48页第三十六页，共48页。3)3)胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：ArgArg修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：本质上是羰基对氨基酰基化。：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：修饰剂：丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛精氨酸（精氨酸（-氨基氨基(nj)-(nj)-胍基戊酸）胍基戊酸）第36页/共48页第三十七页，共48页。4)4)巯基的化学修饰巯基的

37、化学修饰(xish)(xish)来源：来源：CysCys 修饰修饰(xish)(xish)反应反应:烷基化烷基化 修饰修饰(xish)(xish)剂：碘乙酸剂：碘乙酸(IAA)(IAA)碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)(IAM)E-SH+R-X E-SH+R-X E-SR+HX E-SR+HXN-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰）（常用的专一修饰(xish)(xish)巯基试剂）巯基试剂）E ESH SH 第37页/共48页第三十八页，共48页。5)5)二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原还原(hun yun)(hun yun)：巯基乙醇、二硫：巯基乙醇、二硫苏糖醇

38、（苏糖醇（DTTDTT）第38页/共48页第三十九页，共48页。氧化氧化(ynghu)(ynghu)：过甲酸：过甲酸:Performic acidPerformic acid第39页/共48页第四十页，共48页。6)6)咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应:酰基化与烷基化酰基化与烷基化 酰基化修饰剂酰基化修饰剂:常用焦碳酸常用焦碳酸(tn sun)(tn sun)二乙酯（二乙酯（diethyl diethyl paracarbonateparacarbonate）+C2H5OH+CO2+C2H5OH+CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸烷基化修饰剂：碘乙酸+IC

39、H2COOH+HI第40页/共48页第四十一页，共48页。7 7）酚羟基的化学修饰）酚羟基的化学修饰来源：来源：TyrTyr修饰反应修饰反应(fnyng)(fnyng)：芳香环取代反应：芳香环取代反应(fnyng)(fnyng)修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第41页/共48页第四十二页，共48页。8 8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰(xish)(xish)来源：来源：TrpTrp 修饰修饰(xish)(xish)反应：氧化反应反应：氧化反应 修饰修饰(xish)(xish)剂：剂：N-N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺酰亚胺第42页/共48页第四十三页，共4

40、8页。氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲

41、烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种各种(zhn)(zhn)氨基酸侧链氨基酸侧链的修饰剂的修饰剂第43页/共48页第四十四页，共48页。但解释修饰效果须十分小心，因为：但解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些有些(yuxi)(yuxi)修饰剂引起蛋白质构象变化修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。第44页/共48页第

42、四十五页，共48页。4 4、交联修饰（交联法）、交联修饰（交联法）用双功能基团试剂，如戊二醛（用双功能基团试剂，如戊二醛（OHC(CH2)3CHOOHC(CH2)3CHO）分子上对称的两个醛基，分别与蛋白质分子中游分子上对称的两个醛基，分别与蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合，使分子空间构离的氨基、酚基等以共价键结合，使分子空间构象更加稳定。象更加稳定。5 5、固定化修饰（共价偶联法）、固定化修饰（共价偶联法）通过蛋白质分子的酸性或碱性残基，将蛋白通过蛋白质分子的酸性或碱性残基，将蛋白质共价连接到惰性载体上，由于分子所处质共价连接到惰性载体上，由于分子所处(su(su ch)ch)的微

43、环境发生改变，使其最适的微环境发生改变，使其最适pHpH、最适温度、最适温度和稳定性发生改变。和稳定性发生改变。第45页/共48页第四十六页，共48页。举例例1:甘氨酸的pK1=2.34,pK2=9.60.问该氨基酸在pH为5.0时在电场中的移动方向.解:先求出甘氨酸的等电点,再根据等电点与pH的关系,判断其所带电荷,从而可得到答案.GlypI=(pK1+Pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97因为等电点(5.97)大于pH(5.0),故而带负电荷,所以在电场中向正极移动.第46页/共48页第四十七页，共48页。例2:Lys的pK1=2.18,pK2=8.59,pK3=10.53,问

44、在pH为4.0和在11.5时各带何种电荷,并说明在电场中的移动方向.解解.因因LysLys属于碱性氨基酸属于碱性氨基酸,所以所以,它的等电点为它的等电点为:pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56当当pHpH为为4.04.0时时,pI,pI大于大于pH,pH,故是在酸性条件下故是在酸性条件下,氨基酸本身氨基酸本身(bnshn)(bnshn)带正电带正电,在在电场中向阴极移动电场中向阴极移动.当当pHpH为为11.511.5时时,pI,pI小于小于pH,pH,故是在碱性条件下故是在碱性条件下,氨基酸本身氨基酸本身(bnshn)(bnshn)带负电带负电,在在电场中向阳极移动电场中向阳极移动.第47页/共48页第四十八页，共48页。