磁珠提取新课程学习.pptx

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1、会计学1磁珠提取磁珠提取(tq)新新第一页，共31页。核酸提取的总体核酸提取的总体(zngt)要求要求 n n高质量：纯度高并且尽可能不破坏核酸n n高产量：样本(yngbn)量一定时尽可能提取多的核酸n n高通量：同时提取多个标本n n自动化：降低劳动量；生物科技的飞速发展，需要处理的核酸样本(yngbn)迅速增多，自动化提取核酸成为一种迫切需要的选择。第1页/共30页第二页，共31页。磁粒法核酸磁粒法核酸(h sun)提取的特提取的特点点n n步骤：步骤：n n裂解裂解核酸结合核酸结合洗涤洗涤洗脱洗脱n n特点：特点：n n提取时间短提取时间短n n不使用酚、氯仿不使用酚、氯仿n n用磁分

2、离替代离心分离易于自动化，可以实现高通量提取用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现高通量提取n n目前目前(mqin)(mqin)处于市场发育阶段，是未来发展的方向处于市场发育阶段，是未来发展的方向n n主要产品为国外产品：主要产品为国外产品：PromegaPromega、RocheRoche、KingFisherKingFisher、DynalDynal等，大多需要与专用仪器配套等，大多需要与专用仪器配套第2页/共30页第三页，共31页。提取方式 时间自动化 酚、氯仿经典方法长难有玻璃粉法短难没有离心柱法短难没有磁粒法短容易没有各种提取方式操作各种提取方式操作(cozu)比较比较第3页/共

3、30页第四页，共31页。磁粒法核酸磁粒法核酸(h sun)提取基本步提取基本步骤骤n n裂解细胞或病毒颗粒(kl)n n核酸与磁粒结合n n磁分离弃上清n n洗涤缓冲液洗涤磁粒n n磁分离弃上清n n洗脱液将核酸从磁粒洗脱n n磁分离弃磁粒，收集上清第4页/共30页第五页，共31页。结 合洗涤洗脱磁粒法提取(tq)核酸示意图第5页/共30页第六页，共31页。磁粒提取试剂操作磁粒提取试剂操作(cozu)方式方式n n磁架n n磁笔n n自动(zdng)提取仪第6页/共30页第七页，共31页。裂解(li ji)结合(jih)磁分离(fnl)吸去废液洗涤洗脱磁架提取核酸示意图第7页/共30页第八页，

4、共31页。裂解(li ji)结合(jih)转移(zhuny)磁粒洗涤洗脱转移磁粒磁笔提取核酸示意图第8页/共30页第九页，共31页。自动仪器提取自动仪器提取(tq)自动提取的原理与磁笔提取相同，只是(zhsh)用机器的运转代替手工操作，实现高通量提取和减少工作量。第9页/共30页第十页，共31页。磁珠提取磁珠提取(tq)方法的优化方法的优化n n裂解(li ji)：裂解(li ji)液配方，作用时间和温度等n n结合：结合液的选择和用量等n n洗涤：洗涤液配方等n n洗脱：洗脱时间和温度等第10页/共30页第十一页，共31页。主要主要(zhyo)实验结果实验结果n n与其他(qt)方法或类似商

5、业化试剂盒的比较n n核酸提取的灵敏度：HCV RNA，HIV RNA，HBV DNA第11页/共30页第十二页，共31页。与与Qiagen Qiagen 磁珠式核酸磁珠式核酸(h sun)(h sun)提取试剂盒的比较提取试剂盒的比较 n nHCV RNA提取(tq)比较 Ct值方法HCV样本1 HCV样本2 HCV样本3Promega体系平行127.6030.2127.39Promega体系平行227.7230.8427.20Qiagen kit平行127.8639.0028.82Qiagen kit平行227.3333.5828.55第12页/共30页第十三页，共31页。HBV DNA提

6、取(tq)比较方法HBV样本1HBV样本2Promega体系平行126.6532.78Promega体系平行226.8432.52Qiagen kit平行126.7032.96Qiagen kit平行226.7132.28第13页/共30页第十四页，共31页。提取提取(tq)灵敏度实验灵敏度实验n n阳性样本梯度(t d)稀释n n国家灵敏度参考品第14页/共30页第十五页，共31页。HCV RNA提取(tq)HCV阳性(yngxng)样本10倍稀释梯度：100,10-1,10-2,10-3,10-4第15页/共30页第十六页，共31页。磁珠提取与柱提取法比较(bjio)（数据见下页）第16页

7、/共30页第十七页，共31页。稀释组柱提取磁珠提取10-024.1324.3425.2810-127.1529.2028.5710-231.2333.3432.6410-335.3435.8735.3910-438.1638.0738.69磁珠提取(tq)方法与柱提取(tq)法及水溶液梯度稀释样本比较磁珠提取(tq)与柱提法的提取(tq)效果相当。在低浓度样本提取(tq)方面，荧光增量与稀释组无显著差异，此方法在去除样本中抑制物方面效果良好。第17页/共30页第十八页，共31页。HCV RNAHCV RNA国家标准国家标准(u ji bio zhu ji bio zh n)n)品检测品检测10

8、份阳性(yngxng)参考品:P1P10第18页/共30页第十九页，共31页。HCV阳性参考品CtHCV阳性参考品CtP134.58P6NDP2NDP736.18P336.96P8NDP434.81P932.16P535.44P1036.73第19页/共30页第二十页，共31页。HIV RNAHIV RNA提取提取(tq)(tq)HIV阳性样本梯度(t d)稀释成1/5，1/25，1/50，1/100和1/200五个浓度，提取RNA，原样本提取后用TE按相同比例稀释，上机比较。稀释组磁珠提取1-28.881/532.0931.291/535.7833.931/5037.1735.591/100

9、38.8336.121/200-37.33 第20页/共30页第二十一页，共31页。HIV 样本(yngbn)稀释梯度：1/5，1/25，1/50，1/100和1/200第21页/共30页第二十二页，共31页。HIV核酸国家(guji)参考品检测HIV RNA灵敏度和定量参考(cnko)品：B2B5（至少检出B2-B3）第22页/共30页第二十三页，共31页。HIV RNA线性参考(cnko)品：A2A5。第23页/共30页第二十四页，共31页。HIV RNAHIV RNA荧光定量荧光定量(dngling)(dngling)标准曲线标准曲线,线形相关系数线形相关系数:0.9907:0.9907

10、第24页/共30页第二十五页，共31页。HIV 阳性(yngxng)参考品:P1,P2,P3,P5,P7,P8 第25页/共30页第二十六页，共31页。HIV阳性参考品CtHIV阳性参考品CtP132.94P526.42P235.98P728.93P337.61P832.55HIV阳性(yngxng)参考品检测第26页/共30页第二十七页，共31页。中检所中检所HBVHBV核酸定量标准核酸定量标准(biozh(biozh n)n)品检测品检测灵敏度参考品L0L1L2L3L4L5L6理论浓度对数值8.3427.6196.6495.6724.7153.6362.043Ct15.0416.9720.4022.0426.3429.0335.17第27页/共30页第二十八页，共31页。HBVHBV核酸核酸(h sun)(h sun)定量标准品：定量标准品：L0L0L6L6（L0L0L5L5必须检出，必须检出，L6L6仅供参考）仅供参考）第28页/共30页第二十九页，共31页。HBVHBV核酸定量标准核酸定量标准(biozhn)(biozhn)品荧光定量标准品荧光定量标准(biozhn)(biozhn)曲线曲线第29页/共30页第三十页，共31页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第30页/共30页第三十一页，共31页。