Tricine-SDS-PAGE.pdf

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1、Tricine-SDS-PAGE一.试剂及缓冲液AB3 浓缩胶：9.6g 丙烯酰胺 0。3g 甲叉双丙烯酰胺溶于 20ml 水。（49.5T，3Cmixture)AB6 分离胶：9。3g 丙烯酰胺 0。6g 甲叉双丙烯酰胺溶于 20ml 水。(49。5%T，6Cmixture)凝胶缓冲液：1X2.422g Tris,0。02gSDS 溶于 20ml 水，HCL 调节 pH=8。45。样品缓冲液:4X12SDS，6%巯基乙醇，30甘油，0.05%溴酚蓝，0.15MTrisHCL(pH=7。0）？不确定阴极缓冲液（内槽）：10X 1。0MTris 1.0MTricine 1SDS pH 约 8.2

2、5，基本不用调.60。55g Tris，89。58g Tricine,5g SDS溶于 400mL 蒸馏水，定容至 500mL。阳极缓冲液（外槽）：10X 1。0MTris 0.225MHCL pH=8。9,HCL 调节。（121.14g Tris 溶于 400ml 蒸馏水，用 1。0mol/L HCl 调至 pH8。9，定容至500ml）固定液：250ml 甲醇，50ml 冰醋酸,0.05mol 醋酸铵，加水定容至 500ml。(0。7mm，30min)染色液：0.025考马斯亮蓝 G250 10冰醋酸（20min).(0.7mm，20min）脱色液：10%冰醋酸.（0。7mm，2h 或者过

3、夜)二。配胶：0。071414cm 两块胶的用量.（一)分离胶 16gel1.AB-6：5ml2.凝胶缓冲液：5ml3.甘油：1.5g4。蒸馏水 3.5ml5.10APS(硫酸铵）50ul6。TEMED(四甲基乙二胺）5ulA、将不同体积的双蒸水、49.5T 6C、凝胶缓冲液和甘油加入到离心管中混合。B、加入 10%APS 和 TEMED，立即涡旋混匀 510 秒，以使溶液充分混匀。C、在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液（1mm 的 mini-gel，分离胶溶液加约4ml），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层 1-3cm 的水层，使凝胶表面保持平整。D、静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表

4、示凝胶已聚合。(二)夹层胶 10%gel1.AB3：600ul2。凝胶缓冲液:1ml3.Glycerol（甘油）：0。3g4.上蒸馏水 1。1ml5.10APS 15ul6.TEMED 1。5ul去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水尽量吸去。A、将不同体积的双蒸水、49。5T 3%C 和凝胶缓冲液加入到离心管中混合。B、加入 10%过硫酸铵和 TEMED,立即涡旋混匀 510 秒，以使溶液充分混匀。C、将适量的夹层胶溶液迅速加至分离胶的上面（对于 1mm 的 minigel，夹层胶溶液加约 1ml），然后在夹层胶溶液上轻轻覆盖一层水层，使凝胶表面保持平整.D、静置,待夹层胶和水层之间出现

5、一个清晰的界面表示凝胶已聚合。(三）浓缩胶 4gel1.AB-3：500 ul2.凝胶缓冲液:1.5ml3。上述加水至 6ml4.10%APS（硫酸铵)45ul5。TEMED 4.5ul去除覆盖在夹层胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。1、将不同体积的双蒸水、49。5%T 3%C 和凝胶缓冲液加入到离心管中混合。2、加入 10%过硫酸铵和 TEMED，立即涡旋混匀 5-10 秒，以使溶液充分混匀.3、将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。4、待凝胶聚合后，小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。5、进行电泳操作。(四）电泳将电泳槽放入 4或冰水浴中，外槽加入阳极缓冲液（T1225），内槽加入阴极缓冲液（T12

6、15），30V预电泳 10min,将样品(已经过 Tricine 专用上样缓冲液 P1325处理）加入点样孔后 30V电泳 1 小时，100V 电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳，进行后续的考马斯亮蓝染色或电转.三。注意:1.电压：进入分离胶之前 30V，之后 100 V，在跑至分离胶底部之前可以调至 200V.注意温度不能超过 3540。2.本实验适合小蛋白、多肽的分离.1100kD。3。Spacer gel 10%gel 的用途是为了使 15 kD 的小分子得到更好的分离.是否配制,按照自己需要。1、10APS 配制后分装20 度保存。APS 溶液不稳定，应尽量减少室温存放时间，每次取用后立即放回冰箱，以防失效；若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换，使用20 度保存的 10%APS。2、在凝胶配制过程中，尤其是液体混匀步骤，应尽量避免气泡的产生。3、在分离胶上层加蒸馏水时要小心操作，加水时速度不能太快。4、丙烯酰胺具有神经毒性，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。5、TrisTricineSDS-PAGE凝胶制备试剂盒仅用于科研，不能用于人体实验或人体治疗。