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1、包包涵涵体体蛋蛋白白包包被被 E EL LI IS SA A板板检检测测抗抗体体的的流流程程 Hessen was revised in January 2021包涵体蛋白包被 ELISA板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备:在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下,可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被 ELISA 板。(1)完成包涵体的制备和洗涤流程。(2)按照常规流程溶解使用 8M 尿素或者 1%SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体。剧烈震动后,室温静置 30 分钟至 2 小时或者 4过夜,使其缓慢溶解。注:每 100mL 细菌提取的包涵体使用 2mL 含 8M
2、尿素的 Buffer A 溶解;或者每 100mL 细菌提取的包涵体使用 2mL 含 1%SKL 的 Buffer A 溶解(使用前混合,ml Buffer A 加入 ml 20的 SKL 贮存液)。(3)抗原稀释:使用 碳酸盐包被缓冲液(CBS)4 倍稀释包涵体溶解液,分装冻存-20冰箱,减少冻融次数。注意必须由少到多逐渐加入 CBS,边加边震荡,以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。DMSO 溶解的用 CBS 稀释 4 倍。加入 1:2-5 倍 PBS/TE/SW 液体后切胶磨碎,4 度放置 3-7 天,最高转速 4 度离心取上清冻存。二、包涵体包被抗原浓度的确定:1、稀释抗原:取出包涵体抗原,
3、4融化。在 ELISA 板每孔加入 100L CBS。将 100L 抗原加入ELISA 板第一竖排孔中;吹打 4-5 次后,吸出 100L 加到第二竖排孔中;吹打 4-5 次后,吸出100L 加到第三竖排孔中,一次类推,最后一排吸出的 100L 液体弃去。注:每种抗原至少稀释 3 行,一行阳性血清检测,一行阴性血清对照,一行使用含 8M 尿素的 Buffer A做对照。2、包被:4过夜或 37温育 2 小时。弃去孔内溶液,用 PBST 洗 3 次(洗涤方法:在 ELISA 孔中加满PBST,室温静置 5 分钟后弃去,反复三次)。拍干!3、封闭:5%脱脂乳 300L,37温育 2 小时或 4过夜
4、。弃去孔内溶液,用 PBST 洗 3 次,拍干!。封闭不彻底会导致假阳性!4、稀释阳性血清:在本实验中,傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做 1000 倍稀释。5、加样:将 100L 稀释好的血清加入上述已包被之反应孔中,置 37孵育 1-2 小时。用 PBST 洗 3次,拍干!。6、加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标二抗 100L。37孵育不超过 1 小时,PBST 洗涤3 次,拍干!。7、加底物液显色:各反应孔中加入 100L TMB(避光),37 10-30min 显色。注:商品化的 TMB 其实是 TMB 和双氧水的混合物,长期光照、高温甚至生产日期超过 1 个月都会导致试剂
5、失效。8、终止反应:于各反应孔中加入 50L2M 浓硫酸。9、结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“”、“”号表示。也可测定 OD 值:在 ELISA 检测仪上,于 450nm 处,以空白对照孔调零后测各孔 OD 值,若大于规定的阴性对照 OD 值的倍,即为阳性。10、结果分析:观察阴性对照是否也发生反应;选择检测阳性的最高稀释倍数前 3-4 孔的稀释度作为最佳包被浓度。例如,阳性血清如果前 8 孔为阳性,那么以后检测时抗原可以做 2稀释后包板为宜。三、包涵体包被 ELISA 板检测未知抗体:4-51、稀释抗
6、原:按照前期实验结果,用 CBS 稀释抗原。每孔加入 100L 抗原稀释液。2、包被:4过夜或 37温育 2 小时。弃去孔内溶液,用 PBST 洗 3 次(洗涤方法:在 ELISA 孔中加满PBST,室温静置 5 分钟后弃去,反复三次)。拍干!3、封闭:加入 300L 5%脱脂乳,37温育 2 小时或 4过夜。弃去孔内溶液,用 PBST 洗 3 次。拍干!封闭不彻底会导致假阳性!4、加样:将 25-100L 细胞上清或者待检血清加入上述包被孔中,置 37孵育 1-2 小时或 4过夜。用 PBST 洗 3 次,拍干。(根据实验设计,同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔)5、加酶标抗体:于各反应孔
7、中,加入新鲜稀释的酶标二抗 100L。37孵育不超过 1 小时,PBST 洗涤3 次。拍干!6、加底物液显色:各反应孔中加入 100L TMB(避光),37 10-30min 显色。注:商品化的 TMB 其实是 TMB 和双氧水的混合物,长期光照、高温甚至生产日期超过 1 个月都会导致试剂失效。7、终止反应:于各反应孔中加入 50L 2M 浓硫酸。8、结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“”、“”号表示。也可测定 OD 值:在 ELISA 检测仪上,于 450nm 处,以空白对照孔调零后测各孔 OD 值,若大于规定的阴性对照 OD 值的倍,即为阳性。计算公式:(待测样 OD空白 OD)/(阴性对照 OD空白 OD)。大于可判读为阳性。试剂与耗材(1)SDS 裂解液 200mL成分SDSTris pHEDTA终浓度%10mM1mM用量100mM 2mL(2)包被缓冲液(pH M CBS 碳酸盐缓冲液):(3)洗涤缓冲液(pH,M PBS):(4)封闭液:(5)终止液(2 M H2SO4):
限制150内