qPCR实验操作流程.pdf

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1、Q QPCRPCR 实验流程实验流程一、一、实验前准备实验前准备,每天早上到实验室后每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开先把超净工作台的紫外灯打开15-2015-20 分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜一次性薄膜手套，手套，RNARNA 抽提需带口罩。取抽提需带口罩。取 EPEP 管管/枪头时需用镊子，不可以用枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完使用过的手套直接取用。取完 EPEP 管管/枪头后，袋子及时封好。橡胶枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得

2、带出超净台，移液实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，器在一天工作结束后调至最大量程，并用并用 75%75%乙醇清洁移液器，乙醇清洁移液器，枪头枪头盒及超净台面。盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在没有带口罩不要在超净台前讲话超净台前讲话.二、二、总总 RNARNA 抽提抽提1）细胞培养皿中细胞样品用 1PBS 洗两次后,用 1ml 枪将 PBS 吸干净，加入 1ml Trizol(Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1。5ml RNasefreeEP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min;组织样品用液氮

3、充分研磨,加入 1ml Trizol（Invitrogen）溶液，混匀,室温放置 5min 使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入 200l 氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置 35min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4下，14，000g 离心 15min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNasefree EP 管；(用 20200ul 的枪吸取上清，吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀 RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 68 次

4、）（不应用振荡器混匀),室温静置 10min；5）4下，14,000g 离心 10min，收集 RNA 沉淀（如离心后仍不见 EP 管底部有沉淀，应将EP 管放置在-80 度冰箱过夜,继续在 4下，14,000g 离心 10min，收集 RNA 沉淀),去上清；6）用 75乙醇洗涤两次（12,000g 离心 5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP 管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）,超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。17）视沉淀量加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀.三、去基因组三、去基因组使用 RNasefree 的 DNase(Promega

5、）,按以下体系配置反应液，37消化 30min，65灭活 10min。RNADNase 10 x bufferH2O（RNase free)RNasin总体积然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀，室温放置 5min,后 14，000rpm,离心 15min,取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀,静置分层后 14,000rpm,离心 15min,取上清.3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 68 次），20静置15min；4）4下，14,000g 离心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；5）用 75乙醇洗涤两次（12,000g 离心 5min),超净台风

6、干；6）加入适量 DEPC 水（至少 15ul)溶解沉淀。四、总四、总 RNARNA 纯度和完整性检测纯度和完整性检测1）纯度检测:取 1l RNA 样品 50 倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定 OD 值，OD260/OD280的比值大于 1。8，说明制备的 RNA 较纯,无蛋白质污染.2）总 RNA 完整性检测：取 RNA 样品 1l，1琼脂糖凝胶电泳 80V20min，EB染色 10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA 的 5s rRNA，18s rRNA和 28s rRNA 条带，三条条带完整的话即可证明总 RNA 抽提比较完整。五、逆转录五、逆转录1.mRNA1.mRNA：1)在

7、 RNase free 的 PCR 管中配置下列溶液。30201039.50.5100llllll22)将上述溶液吹保温 5min，使立即冰上致冷，性；总体积12lTotal RNA1.0H2Ogl打均匀，置 85RNA 变性。随后以防止 RNA 复3)在该 PCR 管中加入下列试剂（Promega)oligo(dT）0.5lllllllRandom primer0。510mM dNTP2.0RNase inhibitor0。55 x buffer4。0MMLV0。5总体积4)将上述 20l 反应溶液 30保温 10min；5)42保温 50min；6)85保温 10min；7)-20保存。2

8、 2。microRNAmicroRNA：使用茎环逆转录法,原理如下图：1）在去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液.2）将上述溶85 孵打开total RNAX 个 miR 逆转录引物H2O总体积1。00。5*X12。5lgl液 混 匀，育 5min，以RNA 二级结立即置于冰止RNA复性8.0构。随后上，以防再次恢复二级结构；3）在另一去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液：10mM dNTP(promega）RNase inhibitor（promega）U6 逆转录引物5x bufferM-MLV（promega）32.00.50.54。00.5lllll总体积7.5l4）将

9、 3）溶液加入到 1）溶液中，混匀后 30保温 10min；5）42孵育 50min;6）85孵育 10min 灭活逆转录酶。四、定量四、定量 PCRPCR 检测检测1.1.引物测试：引物测试：根据 mRNA 设计的引物正式实验前需进行 qPCR 测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择 Ct 值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的

10、样品排放顺序。（1)一个样品的加样尽可能安排在同一行（2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板3 3正式实验：正式实验：体系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul(TOYOBO）（使用前需振荡均匀）上游引物0。5ul（10uM)下游引物0。5ul(10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配 0。5 份-1 份体系.总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul 每管分装至 8 连管中。3cDNA 用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为

11、 1：20 稀释,如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至 1:10 或 1:5。cDNA 按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中.加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好 112 的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明4的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒.五上机：5.1先开电脑,进入 Windows 界面。接着打开 PCR 仪电源开关。5.2打开 7500 软件，选择“新建，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”（普通基因检测为“60”,Micr

12、oRNA 检测为“65”）5。3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位.5。4点击 File 菜单中 Save，输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写，如 1008301008-WL 表示 8 月 30 日 10 点 08 分魏立的实验.5.5点击 Start 键，开始运行程序。5.6程序运行完毕后,取出样品架上的八连管，按顺序关闭 ABI PRISM 7500 SDS软件、PCR 仪电源开关。5。7在 7500 软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件.反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名,客户的名字。（同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃）5