基因工程知识点超全.pdf

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1、基因工程基因工程一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNADNA 重组和转基因等技术，赋予生重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNADNA 分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做 DNADNA 重组技术。重组技术。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水

2、平基本过程基本过程基因拼接技术或基因拼接技术或 DNADNA 重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA 分子水平分子水平剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达实质（原理）实质（原理）基因重组基因重组克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特结果改造的方向结果改造的方向性性二、基因工程的基本工具二、基因工程的基本工具1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶-“分子手术刀”“分子手术刀”2 2、DNADNA 连接酶连接酶-“分子缝合针”“分子缝合针”3 3、基因进入受体细胞的载体、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”“分子运输车”1

3、 1“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（限制酶）（限制酶）（1 1）存在：主要存在于）存在：主要存在于原核生物原核生物中。中。（2 2）特性：特异性，一种限制酶只能）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，识别一种特定的核苷酸序列，并且能在并且能在特定的切点上切割特定的切点上切割DNADNA分子。分子。（3 3）切割部位：）切割部位：磷酸二酯键磷酸二酯键（4 4）作用：作用：能够识别双链能够识别双链DNADNA分子的分子的（5 5）识别序列的特点：）识别序列的特点：6 6）（切割后末端的种类：切割后末端的种类：DNADNA分子经限分子经限制酶切割产生的制酶切

4、割产生的DNADNA片段末端通常有两片段末端通常有两种形式种形式黏性末端黏性末端和和 平末端平末端。当限制酶当限制酶在它识别序列的在它识别序列的中轴线两侧中轴线两侧将将DNADNA的两的两条链分别切开时，条链分别切开时，产生的是黏性末端，产生的是黏性末端，而而当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的中轴线处中轴线处切开切开时，产生的则是平末端。时，产生的则是平末端。2 2“分子缝合针”“分子缝合针”DNADNA 连接酶连接酶（1 1）作用：将限制酶切割下来的）作用：将限制酶切割下来的 DNADNA 片段拼接成片段拼接成 DNADNA 分子。分子。（2 2）类型）类型种类种类来源来源功能功能

5、特性特性E EcolicoliDNADNA 连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌T T4 4DNADNA 连接酶连接酶T T4 4噬菌体噬菌体只能将双链只能将双链 DNADNA 片段互补片段互补缝合两种末端，但缝合两种末端，但的黏性末端之间的磷酸二的黏性末端之间的磷酸二连接平末端之间的连接平末端之间的酯键连接起来酯键连接起来效率较低效率较低相同点：都连接磷酸二酯键相同点：都连接磷酸二酯键3 3“分子运输车”载体“分子运输车”载体(1)(1)载体具备的条件：载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一个至多个限制酶切点，供外源具有一个至多个限制酶切点，供外源 DNA

6、DNA 片段插入。片段插入。具有标记基因，供重组具有标记基因，供重组 DNADNA 的鉴定和选择。的鉴定和选择。(2)(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状能力的双链环状 DNADNA 分子。分子。(3)(3)其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。(4)(4)载体的作用载体的作用:作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。在受体细胞内对目的基因进行大量复制。在受体细胞内对目的基因

7、进行大量复制。【解题技巧】【解题技巧】(1)(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。失活。(3)(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4 4 个黏性末端或平末端。个黏性末端或平末端。(5)(5)

8、不同不同 DNADNA 分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNADNA 分子用不同的限制酶切分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。割，产生的黏性末端一般不相同。(6)(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。(7)(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNADNA 分子，能将目的分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白

9、质，与细胞膜的通透性有关。基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)(8)基因工程中有基因工程中有 3 3 种工具，但工具酶只有种工具，但工具酶只有 2 2 种。种。例例 1 1限制酶限制酶MunMun和限制酶和限制酶EcoEcoR R的识别序列及切割位点分别是的识别序列及切割位点分别是C CAATTGAATTG和和G GAATTCAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（标记基因。适于作为图

10、示目的基因载体的质粒是（）A A限制酶的应用特点限制酶的应用特点（1 1）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在 DNADNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。来。（2 2）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的

11、基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端五种酶的比较五种酶的比较作用底物作用底物作用部位作用部位形成产物形成产物黏性末端或平末端黏性末端或平末端限制性内切酶限制性内切酶DNADNA 分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA 连接酶连接酶DNADNA 片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键重组重组 DNADNA 分子分子DNADNA 聚合酶聚合酶脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键子代子代 DNADNADNADNA 解旋酶解旋酶DNADNA 分子分子碱基对间的氢键碱基对间的氢键脱氧核苷酸单链脱氧核苷酸单链RNARNA 聚合酶聚合酶核糖核苷酸核糖核苷酸磷酸二酯键

12、磷酸二酯键核糖核苷酸单链核糖核苷酸单链三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1 1、目的基因的获取、目的基因的获取获取目的基因的方法：获取目的基因的方法：（1 1）直接分离法）直接分离法从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多 DNADNA 短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含

13、有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和 cDNAcDNA 文库。文库。直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是：直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是：“鸟枪法”。“鸟枪法”。（2 2）人工合成法）人工合成法化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用 DNADNA 合成仪用化学方法合成，不合成仪用化学方法合成，不需要模板。需要模板。反转录法：以反转录法：以 RNARNA 为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因 DNADNA（

14、cDNAcDNA）。（4 4）利用）利用 PCRPCR 技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR 技术：是一项在生物体外复制特定技术：是一项在生物体外复制特定DNADNA 片段的核酸合成技术。由于片段的核酸合成技术。由于PCRPCR 过程在高温下进行，因过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的此需要使用热稳定的 DNADNA 聚合酶。聚合酶。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。2 2基因表达载体的构建基因工程的核心基因表达载体的构建基因工

15、程的核心(1)(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。和发挥作用。(3)(3)基基 因因 表表达载体的构达载体的构建过程：建过程：3 3 将目的基将目的基因导入受体因导入受体细胞细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的关键是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的关键是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。生物种类生物种类植物细胞植物细胞

16、农杆菌转化法农杆菌转化法体细胞体细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受精卵受精卵原核细胞原核细胞受体细胞受体细胞金榜金榜 P185 P1854 4目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定转转将目的基因插入到将目的基因插入到 TiTi 质粒质粒 的的 T T将含有目的基因的表达载体将含有目的基因的表达载体 Ca2Ca2处理细胞感受态细胞处理细胞感受态细胞化化DNADNA 上农杆菌导入植物细胞上农杆菌导入植物细胞提纯取卵提纯取卵(受精卵受精卵)显微显微 重组表达载体与感受态细重组表达载体与感受态细过过整合到受体细胞的染色体整合到受

17、体细胞的染色体DNADNA上上注射受精卵发育获得具注射受精卵发育获得具 胞混合感受态细胞吸收胞混合感受态细胞吸收 DNADNA程程表达表达有新性状的动物有新性状的动物分子分子 误区警示误区警示(1)(1)标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因基因(表达产物为带颜色的物质表达产物为带颜色的物质)等。等。(2)(2)受体细胞常用植物受精卵或体细胞受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养经组织培养)、动物受精卵、动物受精卵(一般不用体细胞一般不用体细胞)、微生物、微生物(大大肠

18、杆菌、酵母菌肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、需内质网、高尔基体的加工、分泌高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。(3)(3)基因表达载体中，基因表达载体中，启动子启动子(DNA(DNA 片段片段)起始密码子起始密码子(RNA)(RNA)；终止子终止子(DNA(DNA 片段片段)终止密码子终止密码

19、子(RNA)(RNA)。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。(4)(4)目的基因与载体的连接方式有多种，目的基因与载体的连接方式有多种，如目的基因目的基因、如目的基因目的基因、目的基因载体、目的基因载体、载体载体等。载体载体等。例例 3.3.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是 ()A)AA A用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B B以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同以蛋白质的氨基酸序列为依

20、据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C C检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功D D用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接例例 4 4金榜金榜 P187 T2P187 T2四、基因工程的应用与蛋白质工程四、基因工程的应用与蛋白质工程1 1乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较(1)(1)含义：含义：乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物乳腺生物反应器是指将

21、外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。(2)(2)两者区别：两者区别：比较项目比较项目乳腺生物反应器乳腺生物反应器工程菌工程菌动物基因的结构与人类基动物基因的结构与人类基细菌或酵母菌等生物基因的结构与人细菌或酵母菌等生物基因的结构与人基因结构基因结构因的结构基本相同因的结构基本相同类基因的结构有较大差异类基因的结构有较大差异合成的药物蛋白与天然蛋合成的药物蛋白与天然蛋细菌细胞内没有内质网、细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细高尔基

22、体等细基因表达基因表达白质相同白质相同受体细胞受体细胞导入目的基导入目的基因的方式因的方式胞器，产生的药物蛋白可能没有活性胞器，产生的药物蛋白可能没有活性动物的受精卵动物的受精卵显微注射法显微注射法微生物细胞微生物细胞感受态细胞法感受态细胞法需严格灭菌，严格控需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温制工程菌所需的温不需严格灭菌，温不需严格灭菌，温生产条件生产条件度等外界条件对其度等外界条件对其2 2蛋白质工程与基因工程的比较蛋白质工程与基因工程的比较（金榜（金榜 P189P189）区别与区别与蛋白质工程蛋白质工程基因工程基因工程联系联系预期蛋白质功能设预期蛋白质功能设获取目的基因构获取目的基因构计预

23、期的蛋白质结构计预期的蛋白质结构建基因表达载体建基因表达载体过程过程推测应有的氨基酸推测应有的氨基酸将目的基因导入受将目的基因导入受序列找到相对应的序列找到相对应的体细胞目的基因体细胞目的基因脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列的检测与鉴定的检测与鉴定定向改造生物的遗传特定向改造生物的遗传特定向改造或生产人类定向改造或生产人类实质实质性，以获得人类所需的性，以获得人类所需的所需的蛋白质所需的蛋白质生物类型或生物产品生物类型或生物产品可生产自然界没有的可生产自然界没有的只能生产自然界已有的只能生产自然界已有的结果结果蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质联系联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来蛋白质工程是在基因工

24、程基础上延伸出来的第二代基因工程的第二代基因工程基因工程中所利用的基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。3 3、基因工程的应用：、基因工程的应用：金榜金榜 P189P1894 4、基因治疗：、基因治疗：（1 1）概念

25、：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。）概念：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。（2 2）方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。如：腺苷酸脱氨酶（）方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。如：腺苷酸脱氨酶（ADAADA）基因缺陷）基因缺陷症的基因治疗。症的基因治疗。（3 3）基因治疗的途径）基因治疗的途径体外基因治疗：先从病人的体内获得某种细胞进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功体外基因治疗：先从病人的体内获得某种细胞进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。转移的细胞扩增培养，最

26、后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。5 5、基因诊断、基因诊断（1 1）概念：概念：又称又称 DNADNA 诊断，诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。（2 2）方法：）方法：DNADNA 分子杂交技术。它的基因原理是：互补的分子杂交技术。它的基因原理是：互补的DNADNA 单链能够在一定条件下结合成双链，单链能够在一定条件下结合成双链，即能够杂交，这

27、种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对的原则进行。当用一段已知基因的单即能够杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对的原则进行。当用一段已知基因的单链作探针（常用同位素、荧光分子等进行标记）链作探针（常用同位素、荧光分子等进行标记），与变性后的单链基因组，与变性后的单链基因组 DNADNA 接触时，如果两者的接触时，如果两者的碱基完成配对，互补地结合成双链，表明被测基因组碱基完成配对，互补地结合成双链，表明被测基因组 DNADNA 中含有已知的基因序列。中含有已知的基因序列。误区警示误区警示(1)(1)基因治疗后，缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从基因

28、治疗后，缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。(2)(2)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。被改造的蛋白质分子还是无法遗传。(3)DNA(3)DNA 分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链 DNADNA 分子打开。分子打开。(4)(4)青霉素是青霉

29、菌产生的，不是通过基因工程产生的。青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。例例 5 5下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是()A A基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以对现有蛋白质进行改造，基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以对现有蛋白质进行改造，从而制造一种新的蛋白质从而制造一种新的蛋白质B B蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成成来完成C C当得到可以在当得到可以在7070条件下保存半年的干扰素后，条件下保存半年的干扰素后，在相关酶、在相关酶、氨基酸和适宜的温度、氨基酸和适宜的温度、pHpH 条件下，条件下，干扰素可以大量自我合成干扰素可以大量自我合成D D基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的