第八章体内中药制剂分析课件.ppt

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1、第八章第八章第八章第八章 体内中药制剂分析体内中药制剂分析体内中药制剂分析体内中药制剂分析2023/2/9背背 景景 中药制剂成分复杂，尤其是对许多化合物的结构与性质还未能了中药制剂成分复杂，尤其是对许多化合物的结构与性质还未能了解。解。目目前前中中国国有有复复方方丹丹参参滴滴丸丸、血血脂脂康康等等1010种种中中药药处处方方药药正正式式向向美美国国FDAFDA申申请请检检测测认认证证，其其中中有有7 7种种进进入入二二期期临临床床试试验验，其其余余3 3种种正正启启动动一一期期临临床床试试验验。但但迄迄今今为为止止尚尚未未有有中中药药通通过过美美国国FDAFDA认认证证而而进进入入药药品流通

2、品流通。中药制剂要想被国际医学界认可并接受，关键在于如何中药制剂要想被国际医学界认可并接受，关键在于如何采用现代采用现代科学技术手段探明中药作用的物质基础、相互作用机制，为传统中科学技术手段探明中药作用的物质基础、相互作用机制，为传统中药赋予现代科学的内涵药赋予现代科学的内涵。活性成分活性成分相互作用机制相互作用机制体内动态变化规律体内动态变化规律背背 景景中药制剂中药制剂体体内内中中药药制制剂剂分分析析技技术术背背 景景 体内中药制剂分析，研究其活性成分的吸收、分布、代谢、体内中药制剂分析，研究其活性成分的吸收、分布、代谢、排泄、立体选择性、药物的相互作用、药物对内源性代谢的影排泄、立体选择

3、性、药物的相互作用、药物对内源性代谢的影响，阐明中药制剂的作用机制，为中药新药研究提供了新的途响，阐明中药制剂的作用机制，为中药新药研究提供了新的途径。径。体内中药制剂分析技术：核磁共振技术（体内中药制剂分析技术：核磁共振技术（NMRNMR）、色谱质谱）、色谱质谱联用技术（如联用技术（如GC-MSGC-MS、LC-MS/MSLC-MS/MS）、分子生物学技术（如酶联）、分子生物学技术（如酶联免疫吸附、化学发光免疫、荧光免疫方法）等。免疫吸附、化学发光免疫、荧光免疫方法）等。本章内容提要本章内容提要1.1.生物样品制备及贮存生物样品制备及贮存2.2.生物样品预处理生物样品预处理3.3.生物分析方

4、法建立及验证生物分析方法建立及验证1.1.生物样品制备及贮存生物样品制备及贮存1.1.生物样品制备及贮存生物样品制备及贮存1.1 1.1 概念概念 生物样品是指来自于生物机体生物样品是指来自于生物机体的各种体液及组织的样品，如：的各种体液及组织的样品，如：血液尿液唾液脑脊液胆汁胃液脏器淋巴液组织（一）（一）血样血样1.2 1.2 常见生物样品的制备及贮存常见生物样品的制备及贮存 血浆血浆血清血清全血全血自行凝固、静置、离心自行凝固、静置、离心+抗凝剂、静置、离心抗凝剂、静置、离心SerumPlasma+抗凝剂、混匀抗凝剂、混匀Whole blood（不含纤维蛋白原）（不含纤维蛋白原）（含血细胞

5、）（含血细胞）问题：有哪些应用？问题：有哪些应用？应用及贮存应用及贮存w血清多用于血液生化、免疫等方面的测定；血清多用于血液生化、免疫等方面的测定；w血浆多用于凝血等方面的测定；血浆多用于凝血等方面的测定；w全血则多用在血细胞、血常规、血沉等方面的测全血则多用在血细胞、血常规、血沉等方面的测定。定。w关于贮存：血清、血浆视情况分装后关于贮存：血清、血浆视情况分装后-20-20或或-8080备用。备用。（二）尿样（二）尿样临床常用尿液标本种类：晨尿、随机尿、计时临床常用尿液标本种类：晨尿、随机尿、计时尿。尿。关于贮存：应尽量及时新鲜标本检测关于贮存：应尽量及时新鲜标本检测,如不能即如不能即刻检查

6、，应刻检查，应-20-20或或-80-80备用。备用。（三）组织样品（三）组织样品应用及贮存应用及贮存2 2 生物样品的预处理生物样品的预处理提取提取分离分离释放待测成分释放待测成分减少杂质干扰减少杂质干扰使待测成分达使待测成分达到检测限度到检测限度结合物或结合物或络合物络合物富集富集常用生物样品种类：血浆、血清、组织；常用生物样品种类：血浆、血清、组织；采用采用蛋白沉淀、溶剂萃取蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术；预处理技术；蛋白沉淀法因操作简单，在满足分析条件的情蛋白沉淀法因操作简单，在满足分析条件的情况下，应首先考虑该方法。况下，应首先考虑该方法。关于贮存：应尽量及时新鲜标本检测关于贮存：应尽

7、量及时新鲜标本检测,如不能即如不能即刻检查，应刻检查，应-20-20或或-80-80备用。备用。3 3 生物样品分析方法的建立及验证生物样品分析方法的建立及验证分析方法的设计依据分析方法的设计依据在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存在状况、药代动系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文

8、献。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。检索文献，可在最短时间、最小的花费建立一个好的分析方法检索文献，可在最短时间、最小的花费建立一个好的分析方法！这是！这是试验前要做的第一件事！试验前要做的第一件事！http:/ PubMed是因特网上使用最广泛的免费是因特网上使用最广泛的免费MEDLINE，是，是美美国国家医学图书馆国国家医学图书馆(US National Library of Medicine,NLM)所属的国家生物技术信息中心所属的国家生物技术信息中心(NCBI)于于2000年年4月开发的，月开发的，基于基于WEB的生物医学的生物医学信息检索系统信息检索系统,它是它是

9、NCBI Entrez整个数整个数据库查询系统中的一个。据库查询系统中的一个。PubMed界面提供与综合分子生物学界面提供与综合分子生物学数据库的链接数据库的链接，其内容包括：，其内容包括：DNA与蛋白质序列，与蛋白质序列，基因图基因图数数据，据，3D蛋白构象，人类孟德尔遗传在线，也包含着与提供期蛋白构象，人类孟德尔遗传在线，也包含着与提供期刊全文的出版商网址的链接等。刊全文的出版商网址的链接等。3.13.1分析方法的选择分析方法的选择生物样品中的生物样品中的药物浓度药物浓度决定分析方法的决定分析方法的首要因素；首要因素；待待测测组组分分的的理理化化性性质质、体体内内的的存存在在形形式式及及组

10、组分分在在生生物物体体内内的的生生物物转转化化(代代谢谢)途径也是途径也是分析方法的分析方法的重要影响因素重要影响因素，如：如：药物的药物的pKapKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定预处理方法及萃取决定预处理方法及萃取 方法；方法；具有亲脂性具有亲脂性在适当的在适当的pHpH值下用溶剂萃取；值下用溶剂萃取；具有强极性或亲水性具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后 萃取等；萃取等；具有挥发性具有挥发性GCGC测定法；具有光谱或电化学特性测定法；具有光谱或电化学特性分析检测方法；分析检测方法；对酸碱不稳定

11、对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂；避免使用强酸或强碱性溶剂；对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂。避免高温蒸发溶剂。体内药物分析常用分析方法见体内药物分析常用分析方法见p201p201表表8-28-2。目前，常用分析方法：目前，常用分析方法：（1 1）色谱法：气相色谱法）色谱法：气相色谱法(GC)(GC)、高效液相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)、色谱质谱联用法（色谱质谱联用法（LCLCMSMS、LC-MS-MSLC-MS-MS，GC-MSGC-MS，GC-MS-GC-MS-MSMS）等，）等，可用于大多数药物的检测；可用于大多数药物的检测；（2 2）免疫学方法：放射免疫分析

12、法、酶免疫分析法、荧光）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3 3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。w从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如，如HPLCHPLC、GCGC法或法或LC-MSLC-MS、GC-MSGC-MS法，这类方法灵敏度、特法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约多数

13、实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%90%的药的药物浓度测定可以用色谱法来完成。物浓度测定可以用色谱法来完成。w具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。定。GC/MS分析分析气相色谱和质谱气相色谱和质谱(GC/MS)(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组是分析挥发性化学物质的有效组合。合。GC/MSGC/MS要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因此，此，分析物必须具有挥发性，或能够

14、经过化学衍生具有挥分析物必须具有挥发性，或能够经过化学衍生具有挥发性发性。LC/MS分析分析w液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物。因此，。因此，LC/MSLC/MS可以分析的化合物种类范围比可以分析的化合物种类范围比GC/MSGC/MS更广。更广。w常用常用LC/MS LC/MS 分析的样品包括氨基酸（分析的样品包括氨基酸（20 20 种氨基酸中的种氨基酸中的1818种种可以衍生，其余两种不能）和比三糖更大的糖。可以衍生，其余两种不能）和比三糖更大的糖。w最适合作为未知代谢物研究中的探索方法最适合作为未知代谢物研究中的探索方法，或者在多种目标，

15、或者在多种目标代谢物由于挥发性问题不能用代谢物由于挥发性问题不能用GC/MSGC/MS进行分析时采用。进行分析时采用。化合物分类及其最适的分析技术化合物分类及其最适的分析技术3.2 3.2 生物样品分析方法的建立生物样品分析方法的建立初步拟定分析方法后进行一系列试验，通过：初步拟定分析方法后进行一系列试验，通过：（1 1）选择最佳分析条件）选择最佳分析条件 (即分析条件的筛选即分析条件的筛选)；（2 2）验证分析方法的可行性；）验证分析方法的可行性；以确认是否适用于实际生物样品以确认是否适用于实际生物样品(一一)分析条件的筛选分析条件的筛选 取取标标准准物物质质，照照拟拟定定的的分分析析方方法

16、法(不不包包括括生生物物样样品品的的预预处处理理)测定，测定，确定最佳分析检测条件和检测灵敏度。确定最佳分析检测条件和检测灵敏度。如如色色谱谱分分析析时时：调调整整检检测测器器(类类型型、条条件件)、色色谱谱柱柱(型型号号、牌牌号号、填填料料性性状状与与粒粒径径、柱柱长长度度)、流流动动相相(组组分分及及其其配配比比)及及其其流流速速、柱柱温温、进进样样量量、内内标标物物的的浓浓度度及及其其加加入入量量等等条条件件，使使各各物物质质具具有有良良好好的的色色谱谱参参数数(理理论论塔塔板板数数n n、分分离离度度R R、拖拖尾尾因因子子T T)和和适适当当的保留时间的保留时间(t tR R)，目目

17、的的：避避开开其其他他物物质质干干扰扰，且且待待测测物物与与内内标标物物峰峰面面积积比比适适当当，并通过选择适当检测器，获得好的方法灵敏度。并通过选择适当检测器，获得好的方法灵敏度。(二二)分析方法的建立分析方法的建立分析方法建立时，分为以下步骤分析方法建立时，分为以下步骤分析方法建立时，分为以下步骤分析方法建立时，分为以下步骤：1 1 1 1空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验 溶剂溶剂溶剂溶剂(方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)2 2 2 2空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验 (方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)3 3 3 3模拟生

18、物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品试验 方法效能指标方法效能指标方法效能指标方法效能指标4 4 4 4实际生物样品测试实际生物样品测试实际生物样品测试实际生物样品测试 代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物(方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)1 1空白溶剂试验空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）：待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）：待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）：待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）：采采采采用用用用拟拟拟拟定定定定的的的的分分分分析析析析方方方方法法法法进进进进行行行行衍衍衍衍生生生生化化化化反反反反应应应应、萃萃萃萃

19、取取取取分分分分离离离离等等等等样样样样品品品品预预预预处处处处理理理理（反反反反应应应应试试试试剂剂剂剂、衍衍衍衍生生生生化化化化试试试试剂剂剂剂、萃萃萃萃取取取取溶溶溶溶剂剂剂剂等等等等）后后后后，测测测测定定定定响响响响应信号（如应信号（如应信号（如应信号（如HPLCHPLCHPLCHPLC峰面积或峰高）。峰面积或峰高）。峰面积或峰高）。峰面积或峰高）。考察目标考察目标考察目标考察目标方法的特异性；方法的特异性；方法的特异性；方法的特异性；空白值应尽可能小，并能有效校正。空白值应尽可能小，并能有效校正。空白值应尽可能小，并能有效校正。空白值应尽可能小，并能有效校正。对色谱分析法而言对色谱

20、分析法而言可可可可通通通通过过过过改改改改变变变变反反反反应应应应条条条条件件件件、萃萃萃萃取取取取方方方方法法法法或或或或萃萃萃萃取取取取条条条条件件件件（萃萃萃萃取取取取溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的极极极极性性性性、混混混混合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的配配配配比比比比，固固固固相相相相萃萃萃萃取取取取填填填填料料料料性性性性质质质质、冲冲冲冲洗洗洗洗剂剂剂剂与与与与洗脱剂及其用量等），甚至洗脱剂及其用量等），甚至洗脱剂及其用量等），甚至洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型检测器类型检测器类型检测器类型空白试剂信号应不干扰待测物的测定空白试剂信号应不干扰待测物的测定空白试剂信号应不干扰待测物的

21、测定空白试剂信号应不干扰待测物的测定（如（如（如（如R R R R1.51.51.51.5）本步骤主要考察本步骤主要考察本步骤主要考察本步骤主要考察需需需需经经经经化化化化学学学学反反反反应应应应的的的的预预预预处处处处理理理理过过过过程程程程，若若若若预预预预处处处处理理理理过过过过程程程程仅仅仅仅为为为为生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的提提提提取取取取分分分分离离离离，则则则则可可可可不不不不进进进进行行行行该该该该步步步步骤骤骤骤，直直直直接接接接进进进进行行行行空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质试验。质试验。质试验。质试验。2.2.空白生物基质试验空白生物基质试验空白生

22、物基质空白生物基质空白生物基质空白生物基质 (blank biological matrixblank biological matrixblank biological matrixblank biological matrix)如空白血浆如空白血浆如空白血浆如空白血浆照照照照“空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验”项下方法进行预处理并检测项下方法进行预处理并检测项下方法进行预处理并检测项下方法进行预处理并检测考察目标考察目标考察目标考察目标生物基质中生物基质中生物基质中生物基质中内源性物质对测定的干扰；内源性物质对测定的干扰；内源性物质对测定的干扰；内源性物质对测定的干扰；（方

23、法特异性）（方法特异性）（方法特异性）（方法特异性）在在在在待待待待测测测测组组组组分分分分(或或或或特特特特定定定定的的的的活活活活性性性性代代代代谢谢谢谢物物物物、内内内内标标标标物物物物质质质质等等等等)的的的的信信信信号号号号处处处处不应出现内源性物质信号。不应出现内源性物质信号。不应出现内源性物质信号。不应出现内源性物质信号。3.3.模拟生物样品试验模拟生物样品试验 模拟生物样品模拟生物样品模拟生物样品模拟生物样品(又称质量控制又称质量控制又称质量控制又称质量控制,QC,QC,QC,QC样品样品样品样品)空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中加加加加入入入入待待待待

24、测测测测药药药药物物物物，照照照照“空空空空白白白白溶溶溶溶剂剂剂剂试试试试验验验验”项下方法操作。项下方法操作。项下方法操作。项下方法操作。考察目标：考察目标：考察目标：考察目标：方方方方法法法法的的的的线线线线性性性性范范范范围围围围、精精精精密密密密度度度度与与与与准准准准确确确确度度度度、灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度、药药药药物物物物的的的的提提提提取回收率等指标；取回收率等指标；取回收率等指标；取回收率等指标；同同同同时时时时进进进进一一一一步步步步检检检检验验验验生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质以以以以及及及及可可可可能能能能共共共共同同

25、同同使使使使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。对色谱分析法而言对色谱分析法而言应应应应进进进进一一一一步步步步考考考考察察察察待待待待测测测测物物物物(或或或或内内内内标标标标物物物物)与与与与内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质的的的的分分分分离离离离情情情情况况况况如色谱峰的如色谱峰的如色谱峰的如色谱峰的t t t tR R R R、n n n n 和和和和 T T T T 是否与水溶液的一致、是否与水溶液的一致、是否与水溶液的一致、是否与水溶液

26、的一致、色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分（如何确定？）、（如何确定？）、（如何确定？）、（如何确定？）、标准曲线的截距是否显著偏离零点等；标准曲线的截距是否显著偏离零点等；标准曲线的截距是否显著偏离零点等；标准曲线的截距是否显著偏离零点等；以以以以上上上上均均均均可可可可以以以以说说说说明明明明内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质是是是是否否否否对对对对待待待待测测测测药药药药物物物物或或或或内内内内标标标标物物物物质质质质构成干扰。构成干扰。构成干扰。构成干扰。4.4.实际生物样品的测试实际生物样品的测试通通通通过过过过空空空空白白白白生生

27、生生物物物物基基基基质质质质和和和和模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品试试试试验验验验所所所所确确确确定定定定的的的的分分分分析析析析方方方方法法法法及及及及其其其其条条条条件件件件,不不不不能能能能完完完完全全全全确确确确认认认认是是是是否否否否适适适适合合合合于于于于实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的测测测测定定定定，其其其其原原原原因：因：因：因：药药药药物物物物在在在在体体体体内内内内可可可可能能能能与与与与内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质结结结结合合合合(如如如如血血血血浆浆浆浆蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合物物物物)或代谢生成数个代谢产

28、物及其进一步的结合物或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物或缀合物或缀合物或缀合物)等。等。等。等。在建立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试。在建立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试。在建立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试。在建立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试。考考考考察察察察目目目目标标标标：代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物对对对对药药药药物物物物、内内内内标标标标物物物物质质质质的的的的干干干干扰扰扰扰情情情情况况况况，以以以以进进进进一一一一步验证方法的可行性。步验证方法的可

29、行性。步验证方法的可行性。步验证方法的可行性。3.3 3.3 生物样品分析方法的验证生物样品分析方法的验证 基于以下原因需要对建立的分析方法学进基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：行验证：(1)(1)生物样品量少生物样品量少 (2)(2)待测组分浓度低待测组分浓度低 (3)(3)内源性物质的干扰内源性物质的干扰 (4)(4)生物的个体差异较大生物的个体差异较大 从而确保分析方法的重现性和可靠性。从而确保分析方法的重现性和可靠性。验证步骤验证步骤首先为分析方法的验证首先为分析方法的验证首先为分析方法的验证首先为分析方法的验证专专专专属属属属性性性性、精精精精密密密密度度度度与与与与准准准

30、准确确确确度度度度、回回回回收收收收率率率率、定定定定量量量量限限限限与与与与检检检检测限、溶液稳定性测限、溶液稳定性测限、溶液稳定性测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环（融循环（融循环（融循环（Freeze-and-thaw cycle）分析方法的验证分析方法的验证 1 1、专属性、专属性(Specificity)(Specificity)2 2、标准

31、曲线和定量范围（、标准曲线和定量范围（Calibration CurveCalibration Curve）3 3、定量下限（、定量下限（Lower Limit of quantitationLower Limit of quantitation，LLOQLLOQ）4 4、精密度与准确度（、精密度与准确度（Precision and AccuracyPrecision and Accuracy）5 5、样品稳定性、样品稳定性(Stability)(Stability)6 6、提取回收率、提取回收率 7 7、方法学质控、方法学质控 8 8、微生物学和免疫学方法确证、微生物学和免疫学方法确证 （一

32、）方法专属性（一）方法专属性(specificity)又又又又称称称称特特特特异异异异性性性性或或或或专专专专一一一一性性性性，通通通通常常常常与与与与选选选选择择择择性性性性(selectivityselectivity)互互互互用用用用，系系系系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物的能力指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物的能力指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物的能力指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物的能力。要求所检测的要求所检测的要求所检测的要求所检测的信号信号信号信号(响应响应响应响应)系属于系属于系属于系属于待测药物所特有；待测药物所特有；待测药物所特有；

33、待测药物所特有；要求待测物与其代谢物加以要求待测物与其代谢物加以要求待测物与其代谢物加以要求待测物与其代谢物加以区分区分区分区分(分离分离分离分离)的能力；的能力；的能力；的能力；如如如如果果果果专专专专属属属属性性性性不不不不佳佳佳佳，方方方方法法法法的的的的准准准准确确确确度度度度、精精精精密密密密度度度度、线线线线性性性性都都都都将将将将受受受受到到到到影影影影响响响响。因此确保专属性是建立和验证一个分析方法的第一步。因此确保专属性是建立和验证一个分析方法的第一步。因此确保专属性是建立和验证一个分析方法的第一步。因此确保专属性是建立和验证一个分析方法的第一步。考察一个分析方法是否具有专属

34、性，应着考察一个分析方法是否具有专属性，应着重考虑以下几点：重考虑以下几点：1.1.内源性物质的干扰内源性物质的干扰比较比较比较比较待测药物或其活性代谢产物检测信号待测药物或其活性代谢产物检测信号待测药物或其活性代谢产物检测信号待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品）对照品（或标准品）对照品（或标准品）对照品（或标准品）空白生物基质空白生物基质空白生物基质空白生物基质 模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品（空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中添添添添加加加加对对对对照照照照品）品）品）品）如如如如HPLCHPLCHPLCHPLC色谱峰的色谱峰的色谱峰

35、的色谱峰的 t t t tR R R R、n n n n 和和和和 T T T T 是否一致是否一致是否一致是否一致 及与内源性物质色谱峰的及与内源性物质色谱峰的及与内源性物质色谱峰的及与内源性物质色谱峰的 R R R R确证确证确证确证内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰2.2.代谢产物的干扰代谢产物的干扰 比比比比较较较较模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品和和和和用用用用药药药药后后后后的的的的实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的检检检检测测测测信信信信号号号号与与与与代谢产物的代

36、谢产物的代谢产物的代谢产物的R R R R如如如如HPLCHPLCHPLCHPLC色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰的的的的t t t tR R R R、n n n n 和和和和T T T T 或或或或改改改改变变变变色色色色谱谱谱谱条条条条件件件件(色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱)再再再再比较比较比较比较来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定活性代谢物的测定通过通过通过通过HPLC-DADHPLC-D

37、ADHPLC-DADHPLC-DAD和和和和LC-MSLC-MSLC-MSLC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定采用采用采用采用LC-LC-NMRLC-LC-NMRLC-LC-NMRLC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况进行结构的初步推测后，考察其干扰情况进行结构的初步推测后，考察其干扰情况进行结构的初步推测后，考察其干扰情况3.3.联合药物的干扰联合药物的干扰TDMTDMTDMTDM时（治疗

38、药物检测）时（治疗药物检测）时（治疗药物检测）时（治疗药物检测）还要考虑患者可能同时服用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通通通通过过过过比比比比较较较较待待待待测测测测药药药药物物物物及及及及可可可可能能能能同同同同时时时时服服服服用用用用药药药药物物物物的的的的模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样品的检测信号样品的检测信号样品的检测信号样品的检测信号如如如如HPLCHPLCHPLCHPLC色谱峰的色谱峰的色谱峰的色谱峰的 t t t tR R R R、n n n n 和和和和 T T T T 是否一致是否一致是否

39、一致是否一致来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况4.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照除上述方法外，有时还可使用参比方法对照除上述方法外，有时还可使用参比方法对照除上述方法外，有时还可使用参比方法对照参参参参比比比比方方方方法法法法一一一一般般般般选选选选用用用用特特特特异异异异性性性性强强强强、准准准准确确确确度度度度高高高高、线线线线性性性性关关关关系系系系良良良良好好好好的的的的色色色色谱谱谱谱法法法法，如如如如在在在在TDMT

40、DMTDMTDM中中中中使使使使用用用用UV(UV(UV(UV(或或或或RIA)RIA)RIA)RIA)时时时时,可可可可以以以以HPLC(HPLC(HPLC(HPLC(或或或或GC)GC)GC)GC)为为为为参参参参比比比比 参比方法测定结果为横坐标参比方法测定结果为横坐标参比方法测定结果为横坐标参比方法测定结果为横坐标(X X X X););););拟定方法结果为纵坐标拟定方法结果为纵坐标拟定方法结果为纵坐标拟定方法结果为纵坐标(Y Y Y Y)用用用用最最最最小小小小二二二二乘乘乘乘法法法法计计计计算算算算回回回回归归归归方方方方程程程程 Y Y Y Ya a a ab b b bX X

41、 X X (坐坐坐坐标标标标标标标标度度度度相相相相等等等等)、相相相相关关关关系系系系数数数数(r r r r)表表表表示示示示两两两两种种种种方方方方法法法法测测测测得得得得结结结结果果果果的的的的一一一一致致致致性性性性，若若若若 r r r r 1111，表表表表示示示示拟拟拟拟定方法为非线性，如定方法为非线性，如定方法为非线性，如定方法为非线性，如 RIA RIA RIA RIA 中抗血清滴度选择不当。中抗血清滴度选择不当。中抗血清滴度选择不当。中抗血清滴度选择不当。4.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性Y Y Y Ya a a ab b b bX X X X 截截截截距距距距

42、(a)(a)(a)(a)表表表表示示示示拟拟拟拟定定定定方方方方法法法法受受受受到到到到恒恒恒恒定定定定干干干干扰扰扰扰的的的的程程程程度度度度内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质(UV)(UV)(UV)(UV)斜斜斜斜率率率率(b)(b)(b)(b)表表表表示示示示拟拟拟拟定定定定方方方方法法法法受受受受到到到到比比比比例例例例干干干干扰扰扰扰的的的的程程程程度度度度标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原不不不不纯纯纯纯(RIA)(RIA)(RIA)(RIA)与参比方法的相关性比较与参比方法的相关性比较与参比方法的相关性比较与参比方法的相关性比较除显示分析方法的特异性外除显示分析方法的特异性外

43、除显示分析方法的特异性外除显示分析方法的特异性外斜率斜率斜率斜率b b b b表示两种方法测得结果的一致性表示两种方法测得结果的一致性表示两种方法测得结果的一致性表示两种方法测得结果的一致性若若若若参参参参比比比比方方方方法法法法准准准准确确确确度度度度良良良良好好好好，且且且且截截截截距距距距a0,a0,a0,a0,则则则则拟拟拟拟定定定定方方方方法法法法的的的的准准准准确确确确度度度度(回收率回收率回收率回收率)为为为为100b(%)100b(%)100b(%)100b(%)（二）标准曲线与线性范围（二）标准曲线与线性范围标准曲线（标准曲线（standard curve）生生物物样样品品中

44、中所所测测定定药药物物浓浓度度与与响响应应的的相相关关性性（比比例例的的程程度度），通常用回归分析方法所得的回归方程来评价。通常用回归分析方法所得的回归方程来评价。除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式。除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式。回回归归分分析析法法为为最最小小二二乘乘法法（least squares）或或加加权权最最小小二二乘乘法法（weighted least squares）（线性范围较宽时使用加权法）。）（线性范围较宽时使用加权法）。线性范围（线性范围（linear range）标准曲线的最高与最低浓度的区间。标准曲线的最高与最低浓度的区间。模拟生

45、物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度（二）标准曲线与线性范围（二）标准曲线与线性范围(续续)标准曲线标准曲线 用至少用至少5个浓度的标准模拟生物样品建立；个浓度的标准模拟生物样品建立；建建立立标标准准曲曲线线所所使使用用的的模模拟拟生生物物样样品品应应使使用用与与待待测测的的含药生物样品相同的生物基质制备含药生物样品相同的生物基质制备。线性范围线性范围 不包括零点，应能覆盖全部生物样品中的药物浓度；不包括零点，应能覆盖全部生物样品中的药物浓度；不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度。不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物

46、浓度。标准曲线的一般建立方法标准曲线的一般建立方法 标准系列溶液的制备标准系列溶液的制备内标溶液的制备内标溶液的制备标准系列模拟生物样品的制备标准系列模拟生物样品的制备标准曲线的绘制标准曲线的绘制加权最小二乘法加权最小二乘法限度要求限度要求标准曲线的一般建立方法标准曲线的一般建立方法 1.1.标准系列溶液的制备标准系列溶液的制备 标准物质标准物质对照品、标准品对照品、标准品溶剂溶剂水或甲醇（或其他适当溶剂）水或甲醇（或其他适当溶剂）浓度浓度模拟生物样品中药物浓度的模拟生物样品中药物浓度的5050倍以上倍以上 加入量为生物样品总体积的加入量为生物样品总体积的2%2%以下以下 避免标准模拟生物样品

47、与实际样品存在较大差异避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异浓度较低浓度较低应除去溶剂后再加入生物基质应除去溶剂后再加入生物基质 否则否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀 至少含至少含58个浓度点个浓度点(不包括零点不包括零点,即空白即空白)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如如：1、2、5、10、20、50、100(等等比比梯梯度度模模式式比例常数约为比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为若体内平均达峰浓度为50，其，其1/20为为2.5设定最高浓度为设定最高浓度为100，最低浓度为，最低浓度为1

48、(个体差异个体差异)2.2.2.2.内标溶液的制备内标溶液的制备内标溶液的制备内标溶液的制备内标物质对照品、标准品或化学试剂内标物质对照品、标准品或化学试剂内标物质对照品、标准品或化学试剂内标物质对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度与标准系列溶液的中间浓度相当浓度与标准系列溶液的中间浓度相当浓度与标准系列溶液的中间浓度相当浓度与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液如：某标准溶液如：某标准溶液如：某标准溶液5 5、1010、2020、4040、8080、160160

49、、320 320 g/mlg/ml，则内标的浓度应配制成则内标的浓度应配制成则内标的浓度应配制成则内标的浓度应配制成40 40 g/mlg/ml3.3.标准系列模拟生物样品的制备标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质空白生物基质(如血浆如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀加入标准系列溶液适量，涡旋混匀为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失先加入标准溶液先加入标准溶液 再加入空白生物基质再加入空白生物基质涡旋混匀涡旋混匀 实验中的注意事项：实验中的注意事项：1 1、标准模拟生物样品的最高浓度、标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达应高于

50、生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的10105 5。2 2、应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质、应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质后混悬。后混悬。3 3、标准溶液加入到试管中后，、标准溶液加入到试管中后，应先挥干溶剂再加入空白生应先挥干溶剂再加入空白生物基质物基质。（三）定量限（三）定量限方法定量限方法定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation(limit of quantitation，LOQLOQ)系系系系指指指指在在在在保保保保证证证证具具具具有有有有一一一一定定定定可可可可靠靠靠靠性性性