第6章-色层分离法课件.ppt

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1、第六章 色层分离法6.1 6.1 概概 述述6.2 6.2 柱层析柱层析6.3 6.3 纸层析纸层析6.4 6.4 薄层层析薄层层析l色层分离法色层分离法又称又称层析法层析法或或色谱分离法色谱分离法，它的最大，它的最大特点特点是分离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此分离。是分离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此分离。现代的色谱分离技术就是在此基础上发展而来的。现代的色谱分离技术就是在此基础上发展而来的。l色层分离最早是由波兰色层分离最早是由波兰植物学家植物学家植物学家植物学家M茨维特茨维特提出来的。提出来的。他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙的管柱时，他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙

2、的管柱时，发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种分是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种分离方法为色层分离法或色谱分离法。离方法为色层分离法或色谱分离法。6.1 概 述层析法的发展史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn,Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和和g-胡萝卜素。使色谱法开始为胡萝卜素。

3、使色谱法开始为人们所重视。人们所重视。1938Taylor Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941 Martin,Synge 提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。动相（即气相色谱）。1952Martin,James 从理论和实践方面完善了气从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。液分配色谱法。1956Van Deemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离

4、子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975 Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。型电导检测的新型离子色谱法。1981 Jorgenson创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。层析分离图示层析分离图示“层析的本质层析的本质是使一种液体均匀地渗过一个是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过

5、某相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”马丁（马丁（A.J.P.MartinA.J.P.Martin）（）（英）英）一、层析法的条件一、层析法的条件 层析法应具备的因素或条件是：层析法应具备的因素或条件是：1.1.具有两相具有两相 固定相固定相固定相固定相固定不动的一相固定不动的一相 流动相流动相流动相流动相即携带样品流过固定相的流动体。即携带样品流过固定相的流动体。2.2.混合物中各组分的物理化学性质有差异混合物中各组分的物理化学性质有差异 3.3.多次展开多次展开6.1 概概 述述二、层析法的分类二、层析法的分类l

6、 根据根据层析机理层析机理不同的划分不同的划分吸附剂为固定相，利用吸附能力吸附剂为固定相，利用吸附能力强弱的差异来分离强弱的差异来分离利用组分在固定相和流动相间分利用组分在固定相和流动相间分配系数的差异来分离配系数的差异来分离离子交换剂作固定相，利用离子离子交换剂作固定相，利用离子交换亲和力的差异来分离交换亲和力的差异来分离凝胶作固定相，利用对分子大小凝胶作固定相，利用对分子大小的筛分作用来分离的筛分作用来分离 根据根据操作技术操作技术操作技术操作技术的划分的划分操作压力在操作压力在0.5MPa-5MPa之间之间操作压力在操作压力在5Mpa-40MPa之间之间操作压力小于操作压力小于0.5MP

7、a靠溶质分子在电场中的移动速度靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离不同而分离二、层析法的分类二、层析法的分类 根据根据固定相固定相固定相固定相的状态划分：的状态划分：二、层析法的分类二、层析法的分类 根据根据流动相流动相流动相流动相的物态不同的分类的物态不同的分类 二、层析法的分类二、层析法的分类各种层析法的机理及优缺点各种层析法的机理及优缺点 类型类型机理机理优点优点缺点缺点适用范围适用范围吸附层析吸附层析化学、物理吸附化学、物理吸附操作简便操作简便易易受受离离子子干干扰扰各各种种生生物物大大分分子子的的分分离离、脱脱色和去热源色和去热源凝胶层析凝胶层析分子筛的排阻效应分子筛的排阻效应分

8、分辨辨力力高高，不不会引起变性会引起变性各各种种凝凝胶胶介介质质昂昂贵贵，处处理量有限制理量有限制分分子子量量有有明明显显差差别别的的可可溶溶性性生物大分子生物大分子分配层析分配层析溶溶质质在在固固定定相相和和流流动动相相中中分分配配系系数数的的差异差异分分辨辨力力高高，重重复复性性较较好好，能能分离微量物质分离微量物质影影响响因因子子多多，上样量太小上样量太小用用于于各各种种生生物物大大分分子子的的分分析析鉴定鉴定亲和色谱亲和色谱亲亲和和色色谱谱生生物物大大分分子子与与配配体体之之间间有有特特殊亲和力殊亲和力分辨力很高分辨力很高 一一种种配配体体只只能能用用于于一一种种生生物物大大分分子子，

9、局限性大局限性大各各种种生生物物大大分分子子聚焦色谱聚焦色谱等等电电点点和和离离子子交交换换作用作用分辨力高分辨力高进进口口试试剂剂昂昂贵贵蛋白质和酶蛋白质和酶6.2 柱层析一、吸附柱层析二、一、吸附柱层析二、分配柱层析分配柱层析柱层析分离的原理示意图柱层析分离的基本原理柱层析分离的基本原理示意图示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：一、吸附柱层析一、吸附柱层析 1.原理原理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的组分的吸附力吸附力不同而使各组分分离。不同而使各组分分离。6.2 柱层析一、吸附柱层析一、吸附柱层析l吸附剂一般是多孔性的微粒状物

10、质，在其表面具有许吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心（或称吸附位置），吸附中心的数量多少多吸附中心（或称吸附位置），吸附中心的数量多少以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。l当流动相载着溶质当流动相载着溶质A缓缓流过层析柱时，溶质缓缓流过层析柱时，溶质A在固在固定相和流动相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再定相和流动相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再脱附的过程。脱附的过程。6.2 柱层析1、分配系数、分配系数l在在一一定定的的温温度度下下，溶溶质质在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间的的平平衡关系服从分配定律：衡关系服从分配定律：K

11、D=Cs/Cm KD为分配系数为分配系数 Cm，Cs 分别为流动相和固定相中的溶质分别为流动相和固定相中的溶质A的浓度。的浓度。l应用条件：温度一定应用条件：温度一定 低浓度低浓度一、吸附柱层析一、吸附柱层析l试样中各组分的分配系数有差异，分配系数大试样中各组分的分配系数有差异，分配系数大的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保留的时间较长，不易被洗脱下来，而分配系数留的时间较长，不易被洗脱下来，而分配系数小的组分被吸附得较不牢，在柱中保留时间较小的组分被吸附得较不牢，在柱中保留时间较短，易被洗脱下来。短，易被洗脱下来。l洗脱时，吸附力较强的组分，移动的

12、距离小，洗脱时，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。先出柱。一、吸附柱层析一、吸附柱层析2、吸附等温线、吸附等温线 吸附等温线：某种组分在吸附剂表面的吸附吸附等温线：某种组分在吸附剂表面的吸附规律。包括：线形和非线性。规律。包括：线形和非线性。（1）线性吸附等温线）线性吸附等温线Cm：溶质：溶质A在流动相中的浓度在流动相中的浓度Cs：溶质：溶质A在固定相中的浓度在固定相中的浓度当溶质当溶质A在随流动相缓慢流过层析在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断柱的固定相时，在两相中不断吸附、脱附达到平衡吸附、脱

13、附达到平衡 Cm Cs（吸附平衡）（吸附平衡）KD=Cs/Cm Cs 固定相Cm 流动相l洗脱曲线洗脱曲线l若测定流出液中若测定流出液中A的浓的浓度，绘制度，绘制CV的曲线，的曲线，则得到洗脱曲线（又叫则得到洗脱曲线（又叫洗提曲线洗提曲线）。为一对称）。为一对称的层析图谱的层析图谱。CV（2）非线性吸附等温线）非线性吸附等温线l吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数分配系数分配系数分配系数是是不同的。不同的。l吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数KD较大，溶质分子将较大，溶质分

14、子将首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。l随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配系数也渐变小。因此吸附等温线逐渐向下弯曲形成凸形。系数也渐变小。因此吸附等温线逐渐向下弯曲形成凸形。l洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，因而溶质集中的区域前进较快，接着较少的强吸附中心的溶质后被洗因而溶质集中的区域前进较快，接着较少的强吸附中心的溶质后被洗下流出，出现拖尾峰。下流

15、出，出现拖尾峰。Cs 固定相固定相Cm 流动相流动相Langmuir等温线（凸形）Cs 固定相固定相Cm 流动相流动相反Langmuir等温线（凹形）3.吸附剂的选择吸附剂的选择 吸附剂应具有合适的吸附力。吸附剂应具有合适的吸附力。颗粒均匀、大小适宜。颗粒均匀、大小适宜。吸附与解吸可逆。吸附与解吸可逆。不含杂质。不含杂质。不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），与欲分离的物质不发生化学反应。与欲分离的物质不发生化学反应。常用吸附柱介质常用吸附柱介质l无机物无机物吸附介质包括：氧化铝、吸附介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙钙(凝胶型和

16、晶型凝胶型和晶型)、氧化钛和、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。氢氧化锌凝胶等。l聚合物聚合物吸附介质有：琼脂糖、吸附介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等等（1）Al2O3（中性、酸性、碱性）I）Al2O3分类分类l中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的分离中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的分离l酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等l碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质l一般地，能用酸性或碱性一般地，能用酸性或碱性Al2O3分离的也能用中性分离的也能用中性Al2O3分离分离II）Al2O3的活性

17、的活性 活度级活度级I级增强级增强 吸附能力吸附能力 I 减弱减弱l 在不同的温度下活化氧化铝：在不同的温度下活化氧化铝：l 加热至加热至 100150 活化有一定活性活化有一定活性l 150 III级级l 300400 IVVIl 600 脱水开始烧结脱水开始烧结l每一批每一批Al2O3表面积和表面孔结构不一致，活性不同表面积和表面孔结构不一致，活性不同l一般，分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；分离弱极性的组分用活性一般，分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；分离弱极性的组分用活性强的吸附剂。强的吸附剂。（2）硅胶l弹性多聚硅酸脱水制的弹性多聚硅酸脱水制的 l硅氧烷不具吸附性硅氧烷不具吸附性

18、l表面孔穴较小的硅酸吸附能较强表面孔穴较小的硅酸吸附能较强l用途：微酸性，吸附能力较用途：微酸性，吸附能力较Al2O3 弱，可分弱，可分离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）类类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）类弹性多聚硅酸脱水弹性多聚硅酸脱水 OHOH SiOSi SiOH SiSi 硅氧烷硅氧烷 游离型硅酸醛游离型硅酸醛 束缚型束缚型 活泼型活泼型 硅酸醛硅酸醛 硅酸醛硅酸醛 a b c d（3）聚酰胺l乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶l可与酚类，酸类，醌类，硝类化合物形成可与酚类，酸类

19、，醌类，硝类化合物形成氢键而分离。形成氢键基团的吸附能力大氢键而分离。形成氢键基团的吸附能力大l对、间位形成氢键对、间位形成氢键邻位（空间位阻）邻位（空间位阻）l芳香族由于共轭吸附能力大芳香族由于共轭吸附能力大由海洋生物由海洋生物琼脂琼脂提取得到的主要成分提取得到的主要成分 中性不带电中性不带电水溶性线状多糖水溶性线状多糖高亲水性，含大量羟基高亲水性，含大量羟基能制成多孔性凝胶，分离大分子能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：制备：去除带电琼胶成分去除带电琼胶成分 将溶化的琼脂糖采用悬浮将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。得珠状介质。采用交联剂增加介质的机械强

20、度采用交联剂增加介质的机械强度（4）琼脂糖（5）葡聚糖 l-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒。珠粒。性质：性质：l（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）l（2）化学稳定性及热稳定性好）化学稳定性及热稳定性好l（3）孔度与机械强度与交联度有关）孔度与机械强度与交联度有关l（4）用于凝胶过滤分子筛）用于凝胶过滤分子筛应用：应用：水溶液中分离蛋白质等水溶液中分离蛋白质等（6）纤维素l-1,4 相连的相连的D-葡萄糖（偶而有葡萄糖（偶而有1，6 键合）键合）线性线性天然高聚物。天然高聚物。l（1）亲水）亲水l（2）微晶

21、与无定型两部分组成，缺乏孔度）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度l大孔珠状纤维素大孔珠状纤维素l（1）高孔度）高孔度l（2）高机械强度）高机械强度l（3)亲水性强亲水性强 应用：应用：离子交换分离蛋白质介质离子交换分离蛋白质介质性质：性质：（1）丙）丙烯酰胺与交联剂烯酰胺与交联剂N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰 胺共聚。胺共聚。l（2）烷烃骨架与酰胺侧链）烷烃骨架与酰胺侧链l（3）控制交联剂比例可控制网格孔度）控制交联剂比例可控制网格孔度l（4）亲水好，但不如多糖介质）亲水好，但不如多糖介质l (5)机械强度差机械强度差应用应用：（1）凝胶过滤凝胶过滤 （2）电泳介质电泳介质（7）聚丙烯酰胺4、

22、流动相及其选择l(1)流动相洗脱过程的实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞流动相洗脱过程的实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动性洗脱，反之相反。性洗脱，反之相反。l(2)功能团极性：功能团极性：有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成共轭双键多

23、，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。内氢键的化合物。烷烃（烷烃（CH3，CH2）烯烃（烯烃（CH=CH）醚类（醚类（OCH3，OCH2）硝基化合物（硝基化合物（NO2）二甲胺二甲胺酯类（酯类（COOR）酮类（酮类（C=O）醛类（醛类（CHO）硫醇（硫醇（SH）胺类（胺类（NH2）酰胺酰胺 醇类（醇类（OH）酚类（酚类（ArOH）羧酸类（羧酸类（COOH）（3）常用流动相极性常用流动相极性：石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化碳二硫化碳CCl4三氯乙烯三氯乙烯苯苯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酸甲酯甲酯丙酮丙酮正丙醇正丙醇乙醇乙醇甲醇甲醇吡啶吡

24、啶酸酸l在某些情况下可用在某些情况下可用混合流动相混合流动相l聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等溶液等l溶解试样用的溶剂溶解试样用的溶剂极性极性应与流动相相近应与流动相相近 5.洗脱方法及流出曲线洗脱方法及流出曲线 有色物质有色物质分离的洗脱方法分离的洗脱方法 推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。无色物质无色物质分离的洗脱方法及流出曲线分离的洗脱方法及流出曲线 无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。无色物质分层后，可采用流

25、出曲线加以判断。流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。液体积为横座标，得出的曲线。柱层析的洗脱方法柱层析的洗脱方法 洗脱一般有三种方法：洗脱一般有三种方法：恒定洗脱法：恒定洗脱法：逐次洗脱法：逐次洗脱法：梯度洗脱法：梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。恒定洗脱恒定洗脱 分分 步步 洗洗 脱脱 梯梯 度度 洗洗 脱脱 洗脱剂的选择 样品在溶剂中具有一定溶解度。样品在溶剂中具有一定溶解度。一般采用无水溶剂，且与水不互溶。一般采用无水溶剂，且与水不互溶。溶剂沸点适宜。溶剂沸点适宜。纯度要

26、高，无杂质。纯度要高，无杂质。二、分配柱层析二、分配柱层析l分配柱层析是根据欲分离组分在两种分配柱层析是根据欲分离组分在两种互不混溶互不混溶或部分混溶的溶剂间的溶解度差异来实现分离或部分混溶的溶剂间的溶解度差异来实现分离的。的。l这两种互不混溶的溶剂一个是这两种互不混溶的溶剂一个是流动相流动相，另一个，另一个被吸收在载体中，被称为被吸收在载体中，被称为固定相固定相。l流动相流动相载着试样中的各种组分沿着层析柱流动载着试样中的各种组分沿着层析柱流动时，试样中的各种组分就在流动相和固定相间时，试样中的各种组分就在流动相和固定相间进行分配，当不同组分的分配系数有差异时，进行分配，当不同组分的分配系数

27、有差异时，它们在层析柱中的前进速度就不相同，于是得它们在层析柱中的前进速度就不相同，于是得以分离。以分离。二、分配柱层析1.原理原理 分配层析是根据混合物中各组分在分配层析是根据混合物中各组分在两种不相混溶两种不相混溶的溶剂间溶解度的溶剂间溶解度（即分配系数）的不同，使各组分得以分离。（即分配系数）的不同，使各组分得以分离。分配系数分配系数K：当溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在：当溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂（即两相）中的浓度比值为一常数，称分配系数。两种溶剂（即两相）中的浓度比值为一常数，称分配系数。各种组分具有各自的分配系数各种组分具有各自的分配系数K，

28、同一物质，温度不同时，同一物质，温度不同时，K不同。不同。在分配的各组分中，某组分在分配的各组分中，某组分K，则固定相中浓度，则固定相中浓度，K ，后出柱。，后出柱。2.固定相与流动相固定相与流动相 固定相：由载体和一种溶剂（多为水）固定相：由载体和一种溶剂（多为水）组成。组成。流动相：一般是与水互不相溶的有机溶流动相：一般是与水互不相溶的有机溶剂剂。当流动相是水或水溶液，固定相液体是有当流动相是水或水溶液，固定相液体是有机溶剂时，称为机溶剂时，称为反相分配层析反相分配层析。分配柱层析分配柱层析l常用的载体有：硅胶、纤维素、硅藻土等；常常用的载体有：硅胶、纤维素、硅藻土等；常用的固定相有：水、

29、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等用的固定相有：水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂。强极性溶剂。l流动相一般是与水互不相溶的有机溶剂，如正流动相一般是与水互不相溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等。丁醇、正戊醇等。l分配柱色谱常用来分离极性极强的、亲水性的分配柱色谱常用来分离极性极强的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。3.移动速率移动速率 主要是用于比较各组分移动速度的大主要是用于比较各组分移动速度的大小，即在同一时间内，各组分移动距离小，即在同一时间内，各组分移动距离的大小，作为定性之用。的大小，作为定性之用。=6.3 纸层析特点特点：微量操作技术，

30、简便、分离效率高，但分微量操作技术，简便、分离效率高，但分离速度慢。离速度慢。纸层析纸层析(Paper chromatography)是在滤纸上进行的色谱分析法。是在滤纸上进行的色谱分析法。一、定义一、定义 将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性和定量的液定性和定量的液-液分配层析法。液分配层析法。纸层析和萃取一样，也是根据不同物质在两纸层析和萃取一样，也是根据不同物质在两相间的相间的分配比分配比不同而进行分离的（相当于逆流萃不同而进行分离的（相当于逆流萃取）。取）。6.3 6.3 纸层析纸层析6.3 6.3 纸层析纸层析 二、基本原理二、

31、基本原理固定相固定相滤纸是一种惰性载体，滤纸纤维素中吸附着滤纸是一种惰性载体，滤纸纤维素中吸附着的水或其它溶剂作固定相。的水或其它溶剂作固定相。流动相（展开剂）流动相（展开剂）：沿着滤纸流动的溶剂：沿着滤纸流动的溶剂(一般为有机一般为有机溶剂溶剂)。试液点在滤纸上，在层析过程中，试液中各组分，因其试液点在滤纸上，在层析过程中，试液中各组分，因其在两相中的在两相中的溶解度溶解度不同，不同，(也就是也就是 分配系数分配系数KD 不同不同)，因而得到分离。其原理与萃取相似。因而得到分离。其原理与萃取相似。它是一种分配层析。溶质在固定相与展开剂之间反复分它是一种分配层析。溶质在固定相与展开剂之间反复分

32、配。在固定相中分配系数大而在展开剂中分配系数小的，配。在固定相中分配系数大而在展开剂中分配系数小的，在纸条上移动速度慢，停留在纸条的靠近原点端。在纸条上移动速度慢，停留在纸条的靠近原点端。1.层析缸层析缸 2.滤纸滤纸 3.原点原点 4.展开剂展开剂 5.前沿前沿 6.7.斑点斑点123456736.3 6.3 纸层析纸层析1.纸色谱的基本原理纸色谱的基本原理xyRf的计算2.比移值比移值Rf组份分离后,它们在滤纸上的位置用比移值Rf 表示。定义:6.3 6.3 纸层析纸层析比移值比移值R Rf f的大小取决于各组分在二相间的的大小取决于各组分在二相间的分配系数分配系数及滤纸的性质。不同的组分

33、具有不同的分配系数及滤纸的性质。不同的组分具有不同的分配系数,因而也就有不同的因而也就有不同的R Rf f。这就是定性的依据。这就是定性的依据。6.3 6.3 纸层析纸层析3.影响影响Rf的因素的因素(1)欲分离物的欲分离物的性质性质:物质在两相的分配系数物质在两相的分配系数,决定决定了它的了它的Rf大小大小;；(2)展开剂展开剂:同一组分在不同溶剂中同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的选这样的层析剂，使溶质的Rf在在0.05 0.85之间之间,不不同组分的同组分的Rf差值差值 0.05。(3)pH:影响它们的存在状态。影响它们的存在状态。(4)滤纸滤纸:质

34、地均一、厚薄适当、具有一定机械强质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质度、不含杂质(5).温度温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过恒温下进行，温度不超过 0.5oC。(6).展开方式展开方式:展开方式不同展开方式不同,Rf也不同。下行法的也不同。下行法的Rf最大，上行法的最大，上行法的Rf较小，环行法的较小，环行法的 Rf也不大。也不大。1.四、操作技术四、操作技术2.1、载体、载体(滤纸滤纸)（1）滤纸的选择）滤纸的选择 a.要求滤纸

35、质地均匀、平整无折痕边缘整齐要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐 b.要求滤纸的纤维松紧适宜要求滤纸的纤维松紧适宜 c.滤纸的杂质含量少滤纸的杂质含量少6.3 6.3 纸层析纸层析1.（2）层析滤纸的性能与规格）层析滤纸的性能与规格型号杯重G/m2厚度(mm)吸水性(30min内水上升mm)灰分G/m2性能1900.17150 1200.08快速2900.17120 900.08中速3900.1590 600.08慢速41800,34151 1210.08快速51800.32120 910.08中速61800.3090 600.08慢速（3）滤纸的处理）滤纸的处理1.以以0.1 0.4 mol

36、/L HCl(或或 2 mol/L HAc)浸泡数小时浸泡数小时,除去无机杂质后除去无机杂质后,取出用蒸馏水取出用蒸馏水洗净洗净,再将滤纸放在丙酮再将滤纸放在丙酮-乙醇乙醇(1:1)中浸泡中浸泡一周时间一周时间,除去有机杂质除去有机杂质,再取出风干备用。再取出风干备用。6.3 6.3 纸层析纸层析 2、固定相、固定相 纸层析纸层析以吸着在纤维素上的水作固定相。以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。相。3、试样

37、试样（1）试样的溶解）试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。1.四、操作技四、操作技术术（2）点样方法）点样方法a、先用铅笔在距纸条一端先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始线）并在处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：号表示点样位置；见下示意图：b 点样工具：微量注射器、毛细滴管（点样工具：微量注射器、毛细滴管（0.5 mm)c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与点样方法

38、：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，号接触，使点样的斑点直径为使点样的斑点直径为0.2 0.5 cm,每次点样每次点样2 20 m于于滤纸上，以冷风吹干；滤纸上，以冷风吹干；d.干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。析缸中展开。4、展开展开 1.（1）展开剂的选择）展开剂的选择欲分离物在两相中的溶解度；欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间能瞬间达到分配平

39、衡欲分离物在两相间能瞬间达到分配平衡常用的展开剂常用的展开剂水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。酸、无机碱、甲醇、乙醇等。（2）展层方法）展层方法 展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时

40、间，使滤纸吸饱蒸层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。1.A.上行展开上行展开法法将点有试样的滤纸条的下端将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离上升而展层。待溶液上升到距离纸上端纸上端3 4 cm 时，将滤纸取出，时，将滤纸取出，用铅笔在

41、溶剂前沿处画线作记号用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）。（见右图）。对于对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。a.a.纸条的上端暴露在层析缸外，纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；以便令上升的溶剂挥发；b.b.只要保持纸条下端与溶剂面只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连而挥发，展层过程就自动连续地进行；续地进行；c.c.若溶剂沸点若溶剂沸点100100o oC C，则可则可在纸条暴露部分用红外灯烘在纸条暴露部分用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；烤，促使溶剂挥发；d.d.该法不

42、能测量前沿，但可该法不能测量前沿，但可达分离的目的。达分离的目的。玻片玻璃棒原点玻皿剪成锯齿状，剪成锯齿状，便于溶剂滴下便于溶剂滴下B.下行展开法下行展开法 溶剂自滤纸条的溶剂自滤纸条的上端向下降（借助于重上端向下降（借助于重力的作用），具有分离力的作用），具有分离速度快及连续挥发色谱速度快及连续挥发色谱的优点。的优点。C.环行法环行法 又叫又叫径向展开法径向展开法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小

43、相圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。D.双向展开法双向展开法有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。若前后二次展开若

44、前后二次展开剂选择适当，可使各剂选择适当，可使各种组份完全分离。例种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可如，氨基酸的分离可用此法。双向展开法用此法。双向展开法也可以二次使用同一也可以二次使用同一种展开剂展层。种展开剂展层。5、显色显色展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号。记号。a.有色物有色物：直接观察各个色斑：直接观察各个色斑b.无色物无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。笔画下斑点的位置及大小

45、。6、分析、分析1.A.定性分析定性分析：各组分有各自的：各组分有各自的Rf。为了查明未知物的为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验组成，最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验。化学法显色化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基

46、酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。查阅。xyRf 的计算:Rf=x/yx1x2yRf 的计算的计算:Rf 1=x1/yRf2=x2/y这样每一个斑点用两这样每一个斑点用两个个Rf 来描述。来描述。1.B.定量分析定量分析剪洗法剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱）测吸光度，也可将斑点剪下灰化，再用适当的谱）测吸光度，也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。溶剂溶解，测之。比较法比较法：经纸色谱将

47、各种组份分开后，可在相同条：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。进行比较，确定其可能的含量。五、纸层析的应用五、纸层析的应用例氨基酸的分离例氨基酸的分离（固定相为水）（固定相为水）流动相流动相分离情况分离情况 正丁醇：正丁醇：2 mol/L HAc =1 :1酪氨酸、二碘酪氨酸酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水16 :16:0.1 :3.9亮氨酸、异亮氨酸亮氨酸、异亮氨酸流动相分离情况丁醇

48、：醋酸：水32:2:22甲状腺素、二碘酪氨酸流动相：丁醇：HAc:H2O=4:1:5流动相：M甲酚酚：pH=9.33硼酸缓冲液=1 :1亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等例例2.糖的分离糖的分离(固定相为水固定相为水)流动相分离情况醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10 :49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、流动相分离情况流动相：酚流动

49、相：丁醇:醋酸:水=1:1:1鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖醛酸丁醇:乙醇:水=4:1:5低聚糖75%2丙醇：醋酸9:1直链淀粉丁醇:吡啶:水：苯=50:30:3:45棉子糖例脂肪酸的分离例脂肪酸的分离（固定相为水）流动相分离情况95%乙醇：浓氨水100:1同系的直链脂肪酸正己醇：1.5 mol/L 氨水1:1烷氧基酸流动相1:乙醇：浓氨水:H2O=80:5:15流动相2：乙二醇乙醚：桉树脑：88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸流动相分离情况丁醇：醋酸：水 4:1:5

50、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、苯苄胺甲醇：戊醇：苯：水4:2:2:2萘胺、间苯二胺、对苯二胺、苯胺丁醇：1.5 mol/L 氨水1:1C7以下的脂肪酸例例4.胺类的分离胺类的分离（固定相为水）例例5.醇、酚的分离醇、酚的分离（固定相为水）（固定相为水）流动相分离情况丁醇：5%NaHCO3 1:1甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水 4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇流动相分离情况丁醇：醋酸：水 4:1:5苯甲酸、儿茶酚、肉桂酸、邻苯甲酸、儿茶酚、肉桂酸、邻香豆酸、没食子酸、间羟基苯香豆酸、没食子酸、间羟基苯甲