基因工程原理.pptx

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1、第六章第六章 基因工程原理基因工程原理第一节第一节基因工程的概念及其主要内容基因工程的概念及其主要内容第二节第二节基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶第三节第三节基因克隆的质粒载体基因克隆的质粒载体第四节第四节目的基因的分离目的基因的分离第五节第五节基因与载体的重组与导入受体细胞基因与载体的重组与导入受体细胞第六节第六节重组体的筛选重组体的筛选第七节第七节目的基因的表达目的基因的表达第一节第一节 基因工程的概念及其主要内容基因工程的概念及其主要内容一、基因工程的概念：一、基因工程的概念：利利用用DNA体体外外重重组组或或PCR扩扩增增技技术术从从某某种种生生物物基基因因组组中中分分离离感感兴兴

2、趣趣的的基基因因，或或是是用用人人工工合合成成的的方方法法获获取取基基因因，然然后后经经过过一一系系列列切切割割，加加工工修修饰饰，连连接接反反应应形形成成重重组组DNA分分子子，再再将将其其转转入入适适当当的的受体细胞，以期获得基因表达的过程受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程基因工程(gene engineering)常和常和以下名称混用以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechni

3、que)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。二、基因工程的主要内容或（步骤）二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增扩增等步骤，分离出带有目的基因的等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。片段。2、在体外，将带有目的基因的外源、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。3、将重组、将

4、重组DNA分子转移到适当的受体细胞分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的分子的受体细胞克隆。受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。的遗传背景下实现功能表

5、达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程技术及其应用三、基因工程技术及其应用转基因植物转基因植物转基因动转基因动物作为生物作为生物发生器物发生器基因本身也是一个产业基因本身也是一个产业Rockfeller大学将人肥胖基因出售大学将人肥胖基因出售0.2亿亿美元美元（1995年年3月）月）Amgen公司将公司将FKBP神经免疫因子配体转神经免疫因子配体转让达让达3.29亿美元亿美元（1997年）年）Millennium公司以公司以4.65亿美元亿美元向向Bayer公公司转让司转让225种基因的开发权（种基因的开发权（1998年年9月）月）蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念在基因工程技术对编码蛋白质的

6、基在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。的和更有效的蛋白质。蛋白质工程主要内容蛋白质工程主要内容主要目标主要目标蛋白质氨基酸序列的分析蛋白质氨基酸序列的分析蛋白质晶体结构分析蛋白质晶体结构分析蛋白质功能预测和分析蛋白质功能预测和分析蛋白质组分析蛋白质组分析酶工程的概念酶工程的概念是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶是酶学与

7、工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。为有用物质的技术。传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别是利用是利用DNA操作技术，修饰改造酶分子的结构或活操作技术，修饰改造酶分子的结构或活性

8、位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟性位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。酶的人工设计与合成等成为新的内容。酶工程的主要内容酶工程的主要内容酶的分离纯化酶的分离纯化酶与细胞的固定化技术及反应器酶与细胞的固定化技术及反应器酶制剂的发酵生产酶制剂的发酵生产酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶抑制剂与激活剂开发与研究酶抑制剂与激活剂开发与研究人工设计与合成模拟酶及酶分子人工设计与合成模拟酶及酶分子发酵工程概念发酵工程概念发酵工程属于生物技术的下游技发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产术，是工业化大

9、规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。生物制品的一种技术。传统的发酵工程主要用于微生传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。细胞和工程菌的发酵培养。发酵工程技术发酵工程技术发酵对象：发酵对象：传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物细胞培养、植物细胞培养细胞培养、植物细胞培养发酵类型：发酵类型：液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式发酵发酵发酵技术设备发酵技术设备生物技术的应用领域生物技术的应用领域医药：医药：生物制药；基因治疗；人工器官生物制药；基因治疗

10、；人工器官农业和畜牧业农业和畜牧业转基因植物转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、：抗病虫害新品种、抗逆新品种、高高品质新品种品质新品种转基因动物转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品：生产有用蛋白质和高品质的畜产品生物反应器生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质器，直接生产有用蛋白质轻工与食品轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶环境环境污染治理；废物利用；污染物生物降解污染治理；废物利用；污染物生物降解生物技术产业化生物技术产业化生物技生物技术产业：利用利用细胞和生物分子胞和

11、生物分子进行行药品、品、农产品生品生产开开发和和环境治理的境治理的产业，该产业技技术由医由医药生物技生物技术、农业生物技生物技术和和环境境生物技生物技术共同共同组成成医医药生物技生物技术重点攻克癌症、艾滋病、老年重点攻克癌症、艾滋病、老年痴呆症、帕金森病、心痴呆症、帕金森病、心脏病、糖尿病等危害病、糖尿病等危害人人类的的顽疾疾农业生物技生物技术着眼于提高着眼于提高农产品的品的产量和量和质量。量。环境生物技境生物技术重点用于清除危重点用于清除危险废弃物弃物生物制药产业化特点生物制药产业化特点高技术高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透高投入高投入：在国

12、外，一个生物药品平均要投入：在国外，一个生物药品平均要投入13亿亿美元，并随着开发难度的增大美元，并随着开发难度的增大,有逐步增高的趋势有逐步增高的趋势长周期长周期：国际上，一个新的生物药品需要：国际上，一个新的生物药品需要68年时年时间间高风险高风险:一个新药品的开发，经过一系列的程序一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、研发、中试、动物实验、IIII期临床实验，上市和期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃尽弃高回报高回报:开发成功一个新的生物药品开发成功一个新的生物药品,回报很高。回报很高。如美国如

13、美国Amgen公司，首次开发上市的公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到到1997年的销售额分别接近和达到年的销售额分别接近和达到20亿美元亿美元基因工程试剂的高回报基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子231元元/ug红细胞生成素红细胞生成素1072元元/ug白细胞介素白细胞介素-2410元元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元元/ug胰岛素胰岛素10.2元元/mg美国生物技术产业发展情况美国生物技术产业发展情况 美国生物制药产品种类及数量美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类疾病种类产品数量产品数量疾病种类疾病种类产品数量产

14、品数量感染性疾病感染性疾病39心脏病心脏病26神经系统疾病神经系统疾病28呼吸系统疾病呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病自主免疫系统疾病19皮肤病皮肤病19移植移植13消化系统疾病消化系统疾病11遗传疾病遗传疾病11血液疾病血液疾病9糖尿病及并发症糖尿病及并发症7不育症不育症5眼病眼病3生长发育不良症生长发育不良症3骨质疏松骨质疏松2妊娠预防妊娠预防2肿瘤疾病肿瘤疾病175基因治疗人数情况基因治疗人数情况生物技术产业化生物技术产业化农业领域农业领域已有已有35个科个科120多种植物获得转基因植物，一多种植物获得转基因植物，一些重要的农作物获得商品化的转基因品种

15、。些重要的农作物获得商品化的转基因品种。种植面积迅猛发展。种植面积迅猛发展。采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。植物反应器生产稀有蛋白。植物反应器生产稀有蛋白。世界转基因作物大田释放情况世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物特性转基因作物特性批准项数批准项数所占比例所占比例抗除草剂抗除草剂129729.6%抗虫抗虫104623.8%提高产品质量提高产品质量88620.2%抗病毒抗病

16、毒4369.9%改善农学性状改善农学性状2114.8%抗真菌病抗真菌病2084.7%其他其他3036.9%总计总计4387100%转基因作物种植面积转基因作物种植面积生物技术与传统中药生物技术与传统中药中药现代化中药现代化核心是建立与现代基因学说相应的现代中药核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论理论现代中药理论的建立现代中药理论的建立确立中药与基因表达的关系确立中药与基因表达的关系中药药靶中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找（基因）或作用位点基因的寻找中药化学组中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分中药临床药效中药临床药效的科学评价与分

17、析方法的科学评价与分析方法生物技术的应用生物技术的应用中药基因组中药基因组利用现代生物技术研究分析中药对人体（细利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因表达（蛋白质）的影响。胞）基因表达（蛋白质）的影响。技术平台技术平台：大规模基因表：大规模基因表达分析（基因芯片、达分析（基因芯片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立息数据库的建立中药化学组中药化学组利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、动力学。物代谢、动力学。技术平台技术平台：色谱及色谱：色谱及色谱-质谱，色谱质谱，色谱-波谱，波谱，波谱波谱-波谱

18、联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术中药新剂型中药新剂型第二节第二节 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰其其它它酶酶类类-用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（

19、二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）同裂酶）（五）、（五）、限制酶的用途限制酶的用途（一）、限制修饰系统的种类（一）、限制修饰系统的种类1.I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸），无特异切割位腺苷甲硫氨酸）

20、，无特异切割位点。点。2.II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3.III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsd与与hsd基因基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。因工程中。（二）、限制性内切酶的定义、命名（二）、限制性内切酶的定义、命名1.定义定义：广义指上述三个系

21、统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭狭义指义指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。系编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()（三）、限制酶的特点（三）、限制酶的

22、特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧，产生外侧，产生-端突起端突起）富含）富含）对称性）对称性双双对称对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和

23、和-2.末端种类末端种类）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组组DNA分子。在进行分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割

24、目的基重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组重组DNA分子分子）平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;C

25、CCGAG;CTCGAG（四）、异源同序酶（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶），同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制多种限制酶酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG（五）、（五）、限制酶的用途限制酶的用途1.DNA重组重组2.限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制

26、酶的特点型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。5.均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108kD。酶切图谱的构建（酶切图谱的构建（a a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱酶切图谱的构建（酶切图谱的构建（b b）二、二、DNADNA甲基化甲基化酶

27、酶（一）、一）、甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺甲基腺嘌呤。嘌呤。在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。酶作用位点可同可不同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEco

28、RIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCCBamHI(G GATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(G AATTC)）抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠顺序边界重叠如：如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性MTaqI（TCGmA）-Hind

29、II（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成的形成）在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基分子部分甲基化，然后再用限制酶切化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE三、核酸酶（一）、外切酶一）、外切酶II

30、I（ExoIII）1.一般特点：一般特点：来自于来自于E.coli，分子量，分子量28,000kD2.催化反应类型催化反应类型1)外切酶活性：外切酶活性：35，产生，产生5-单磷酸核苷酸和具各单磷酸核苷酸和具各种结构的种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶核酸酶H活性：除去活性：除去DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA分子，分子，pH7.6-8.53)3-磷酸酶活性：除去磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成磷酸基后形成3-OH端，端，有利于有利于DNA聚合酶反应，聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，键切

31、开，pH7.6-8.53.外切酶活性特点外切酶活性特点1)反应底物：互补反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的端突起的ds-DNA，过度反应将导致，过度反应将导致DNA降解降解4.用途用途1)核酸（核酸（DNA）标记）标记2)基因突变基因突变-缺失缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，在一定条件下，ExoIII不能作用不能作用GC富集区富集区

32、(来自来自于于cDNA加尾加尾)ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HOP53HOP55P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和的外切酶和RNaseH的作用的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失用于顺序缺失ExoIII ExoIII-32P-32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH3

33、3HOOH3ExoIII用于用于DNA标记标记（二）、（二）、Rnase（三）、（三）、RNaseH（二）、（二）、RNase大部分用于大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样样品或蛋白质合成系统中的品或蛋白质合成系统中的RNA分子。分子。1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNA样品中的样品中的RNA分子分子2.核酸酶核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源蛋白质合成系统中的内源mRNA（

34、三）、（三）、RNaseH作用于作用于DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文文库建立时除去库建立时除去R RNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的合成。链的合成。（四）、（四）、DNaseI1.特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列，但无核苷酸序列特异型，产生特异型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值可使酶活达最大值当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：类型二价阳离

35、子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关，存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条存在时，两条链上的切口几乎在同一位置链上的切口几乎在同一位置2.用途用途1)切口移位，制备切口移位，制备DNA探针探针2)制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子3)基因突变时产生切口基因突变时产生切口 Mn+存在时存在时Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNaseIHOP535353DNaseI与与PolI的的切口移位切口移位PolI四、四、DNADNA聚合酶聚合酶（一）、（一）、E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI）1.E.coli的

36、的DNA聚合酶系统聚合酶系统PolI参与参与DNA修复修复,具具35和和53外切酶活性外切酶活性polII同上同上具具35外切酶活性外切酶活性polIII参与参与DNA复制复制,具具35和和53外切酶活性外切酶活性2.E.colipolI的特点的特点 1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片外切酶活性，大片段具段具35外切酶活性外切酶活性(大片段亦称为大片段亦称为Klenow片段片段,polIK)2）聚合酶活性，聚合酶活性，53

37、,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受，其延续性受反应条件的影响反应条件的影响3）外切酶活性外切酶活性3.用途用途 1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大常用大片段片段（二）、（二）、T4DNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：53聚合酶活性，聚合酶活性，1500nt/min,为为polI的两倍的两倍35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其切除其切除速度分别为速度分别为40和和4000

38、nt/min2.用途：用途：制备高比活性探针制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);DNA末端修末端修饰饰-缺失缺失外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP（三）、（三）、TaqDNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温，最适反应温度度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性外切酶活性2.用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才进入酶次循环后才进入酶的反应稳定期，一个的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增分子因而可被扩增

39、4106倍。倍。DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括以下，它包括以下三个步骤：三个步骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退火引物退火(45)引引物延伸物延伸(75)TaqPol和和PCR 53变性变性 3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸533535 五、连接酶（一）、（一）、T4DNA连接酶连接酶1.特点：特点：只连接只连接ds-DNA分子，要求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷酸基磷酸基2.用途：用途：1)相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果平端

40、来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶限制酶与其它酶共同作用结果共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多得多，所需的酶量也多5-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3PAGCTTAOH3-TTCGAA-53-TTCGAPHOA-5HOATTCGAP 退火退火5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5或或 5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5T4DNA连接酶连接酶5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5或或 5-A

41、AGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5T4DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应(两种插入方向两种插入方向)+第三节第三节 分子克隆的质粒载体分子克隆的质粒载体 一、质粒的一般生物学特性；二、质粒DNA的分离与纯化；三、质粒载体的构建及类型；四、常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性一、质粒的一般生物学特性（一）、质粒（一）、质粒DNA1、质粒质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒质粒。R质粒可将其抗性转移到质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受

42、体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。能力。2、质粒、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，动子后，可以构建出能在原核和真

43、核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环），开环DNA（ocDNA），线性），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开中分开。（二）、质粒的拷贝数与不亲和性（二）、质粒的拷贝数与不亲和性1 1、质粒的拷贝数质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。目。

44、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-51-5个）与松个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-20010-200份拷贝）。因份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2 2、质粒的不亲和性质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在不能够在同一个

45、寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。二、质粒二、质粒DNADNA的分离与纯化（放的分离与纯化（放在实验中讲）在实验中讲）三、质粒载体的构建及类型三、质粒载体的构建及类型（一）质粒载体的发展概况；（一）质粒载体的发展概况；（二）质粒载体的特点（基本条件）；（二）质粒载体的特点（基本条件）；（三）遗传标记基因（三）遗传标记基因（四）质粒载体的类型（四）质粒载体的类型（一）发展概况（一）发展概况1.第一阶段（第一阶段（1977年前

46、）：年前）：天然质粒和重组质粒天然质粒和重组质粒的利用，如的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。系列载体。3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及

47、各种探针型载体。（二）载体特点（二）载体特点1、至少有一个复制起点，因至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自而至少可在一种生物体中自主复制。主复制。2、至少应有一个克隆位点，至少应有一个克隆位点，以供外源以供外源DNA插入。插入。3、至少应有一个遗传标记基至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高、具有较小的分子量和较高的拷贝数。的拷贝数。注：前三个特点必不可少注：前三个特点必不可少。（三）遗传标记基因（三）遗传标记基因1、标记基因的作用标记基因的作用1）指示外源）指示外源DNA分子（载体或

48、重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞是否进入宿主细胞这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可），也可以是非选择性的（如以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源）指示外源DNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。*这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcS），也可以是），也可以是非选择性非选择性的（如的（如TcS，lacZ），绝大多数为后者。），绝大多数为后者。*有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；

49、当完成第二作用时，目前多采用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（标记基因（lacZ等）。等）。2 2、标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）主要是主要是抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Amp:Ampr r ，TetTetr r ，CmlCmlr r，KanKanr r，StrStrr r 2 2）生化标记基因生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，

50、如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制、常用的遗传标记基因及其作用机制1)四环素抗性基因四环素抗性基因（TetTetr r，Tcr）Tetracycline可结合在核糖体可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白蛋白质，与细菌细胞膜结合，质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入阻止四环素分子进入细菌细胞。细菌细胞。2)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（AmpAmpr r，Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌