核酸探针技术在食品检测中的应用.docx

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1、EAST CHINA INSTITUTE OF TECHNOLOGY科目：食品生物技术导论学院：化同学物与材料科学学院专业：生物技术班级:090551学号：09055106姓名：黄菁核酸探针技术在食品检测中的应用摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备 方法以及在食品检测中的应用及进展方向。关键词：食品检测核酸探针基因工程The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing杂志 2001(03)5 .徐茂军基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用期刊论文-食品与发酵工

2、业 2000(12)6 .翁文川.李志勇.胡科锋基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌期刊论文-食品科 技 2003(01)7 .吴仲梁.李晓虹.韩伟采用商品DNA探针对食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检 测评估期刊论文-中国人兽共患病杂志 2002(05)Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in fo

3、od testing and development direction.Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义食品检验检测对于保障食品平安、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以 来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满意现代食 品检测的需要，随着生物技术的进展，人们已逐步熟悉到生物技术在食品检验中的重要作 用及其意义。生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎 涉及到了食品检验的各个方面，包括食品

4、的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及 食品科学讨论。生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的 物理化学方法相结合，产生一些简洁、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的 检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。二、核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可 被特别的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称 为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序

5、列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序 列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具 有独特的核酸片段，通过分别和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等讨论。(-)核酸探针的种类1 .按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核首 酸探针等几类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中， 前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的 DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高 纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获

6、得的产物即为cDNA。cDNA探针适用 于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不便利且 RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。用人工合成的 寡聚核苗酸片段做为核酸杂交探针应用非常广泛，可依据需要随心所欲合成相应的序列， 可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。2 .按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为 标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位

7、素有 32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测 到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射 性标记的探针不能实现商品化。目前，很多试验室都致力于进展非放射性标记的探针。目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是 半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定 的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子，可采用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。 地高辛标记

8、核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标 记，其应用日趋广泛。(二)核酸探针的标记1 .放射性同位素标记法常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核甘三磷酸(dNTP)上做为标记物，然 后通过切口平移法标记探针。切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌 DNA聚合酶I (E.coli DNApolymerase I)的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新 形成的DNA链中去，形成匀称标记的高比活DNA探针。2 .非放射性标记法可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核 酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛

9、等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。 其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是采用能被可见光激活的生物素衍生物- 光敏生物素(photobiotin),光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照耀下，可与核 酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链DNA及RNA的标记,探 针可在-2(TC下保8-10个月以上。除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过PCR反 应直接完成。(三)核酸杂交杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结 合到肯定的固相支持物上，再与液相中的标记探专理行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素 膜(nitrocellulose

10、filter membrane ,简称 NC 膜)或尼龙膜(nylon membrane)o固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；其次，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特 点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将 载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞 内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定 有无该病原体的感染

11、等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列 有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。近年来液相杂交技术有所进展。液相杂交与固相杂交的主要区分是不用纯化或固定的 靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高， 增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还有肯定的距离。各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最为广泛，它由以下三个基本过程组成。(1) 酸印迹技术(1)斑点印迹(Dot-blot)将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。(2) Southern 印迹(Southern blot)转移到固相支持物上的过程。Sou

12、thern印迹的操作方法有三种：毛细管转移(或虹吸印迹)。电转移。采用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简 洁、快速、高效的目的。真空印迹法这是近年来进展起来的一种简洁、快速、高效的DNA和RNA印迹法。其基本原理 是采用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液 移置到凝胶下面的固相支持物上。Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对NC膜 可用8(TC真空烘烤2小时，对尼龙膜还可用短波紫外线(波长254nm)照耀几分钟。(3) Northern 印迹(Northern blot)Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分别后，

13、转移到固相支持物上的过程。 RNA样品经Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异mRNA分子的量与大小。2.杂交反应的基本过程杂交反应包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。预杂交的目的是用非特异性DNA分子(能精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子 化合物(Denhart s溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避开这些位点与探针 的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在肯定温度和 条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及 未杂交的标记探针，以避开干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后，将连续进行杂交信号的 检测。3杂交信号

14、的检测当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行。即采用放射线在X光 片上的成影作用来检测杂交信号。操作时，在暗室内将滤膜与增感屏、X光片依序放置暗 盒中，再将暗盒置-7(TC曝光适当时间，取出X光片，进行显影和定影处理。对于非放射 性标记的探针，则需将非放射性标记物与检测系统偶联，再经检测系统的显色反应来检测 杂交信号。以地高辛的碱性磷酸酶检测反应为例，地高辛（Dig）是一种半抗原，杂交反应 结束后，可加入碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体，使之在膜上的杂交位点形成酶标抗体Dig 复合物，再加入酶底物如氮蓝四嗖盐（NBT）和5-浪-4-氯-3-明|珠酚磷酸甲苯胺盐（BQP）, 在酶促作

15、用下，底物开头显蓝紫色。其基本反应程序类似ELISA ,杂交信号的强弱，通过 底物显色程度的深浅、有无来确定。三、在食品检测中的应用一、以DNA为靶目标的检验中国开展的食品微生物检验项目主要包括细菌总数、大肠菌群、沙门菌、霉菌和酵 母以及毒素等。所以，有关的检测有很多是针对细菌而来的DNA是细菌的主要遗传物质, 所以设计的探针一般是目标DNA的互补序列。在设计探针时要依照待检测微生物特异的 DNA序列。比如在设计检测产气荚膜梭菌的探针时，克隆的是产气荚膜梭菌的产毒基因。 致肠病的大肠杆菌则针对其致肠病的基因序列来设计。这种检验在食品微生物检测中的应 用讨论非常活跃，例如：如食品中的大肠杆菌、沙

16、门菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森、产 单核细胞李斯特菌、金黄色葡萄球菌的检测等二、以rRNA为靶目标的检验该种检验方法常使用AccuProbe基因作为探针，其原理是采用Acridinium ester作为 荧光发光物质，标记特异性单链作为探针，与待测细菌中的核糖体RNA互补，形成稳 定的DNA,RNA杂交体。选择试剂再将未结合的多余探针破坏掉,最终通过发光仪检测标 记的杂交体。翁文川等应用该方法检测食品中产单核细胞李斯特菌，结果表明，采纳该 基因探针方法检测食品中产单核细胞李斯特菌特异性强，需要的时间短。吴仲梁等也用 AccuProbe检测食品中的产单核细胞李斯特菌，同样证明该方法具有正确、灵敏

17、、快速、 简便等优点，适于推广应用。三、核酸杂交技术应用于食品微生物检验的优点、问题和展望采用核酸杂交技术进行食品微生物检验比传统方法更加精确、灵敏，但同时也增加了假阳性消失的机会。所以在试验过程中，肯定要保证明验环境的洁净，避开其 它DNA造成的污染。将来，核酸杂交技术会越来越多地和其它技术手段相结合，应用于 食品微生物的检验中；DNA芯片也会随着其成本的降低而被推广应用。 核酸探针技术已 被广泛应用于进出口动植物及其产品的检验。用于检验食品中一些常见的致病菌及产毒素 菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等多种病原体的检验。近年来，放射性同位素标记的核酸探针 正越来越多地用于产肠毒素性大肠杆菌的快速检测。参考文献：1 .Robert FW Molecular Biology 20022 .宁红.秦秦分子生物学技术在检疫性有害生物诊断中的应用期刊论文-植物检疫 2002(02)3 .李志勇.胡小云.凌莉国内外的食品微生物检验期刊论文卜检验检疫科学2004(06)4 .王平.孙晓苏.刘汉芬应用DNA探针技术快速检测食品中产气荚膜梭菌产肠毒素基 因的讨论期刊论文-中国预防医学