核酸的性质与研究方法.ppt

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1、 核酸的理化性质 核酸的分离纯化、测定及研究方法 核酸的理化性质 核酸的性质是由其结构决定的。核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构核酸的结构特点特点是分子大是分子大,有一些可解离的基团有一些可解离的基团,具有共轭具有共轭双键等双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础质的基础.下面介绍几种重要的性质下面介绍几种重要的性质:一、物理性质一、物理性质1 1、性状性状：RNARNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；的粉末或结晶；DNADNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。则为疏

2、松的石棉一样的纤维状固体。2 2、溶解性溶解性：RNARNA和和DNADNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。DNADNA和和RNARNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNADNA核蛋白与核蛋白与RNARNA核蛋核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNADNA蛋白在低浓度的盐溶液中蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在随盐浓度的增

3、加而增加，在1 1mol/Lmol/L的的NaCNaC溶液中溶解度比纯水高溶液中溶解度比纯水高2 2倍，在倍，在0.140.14mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶液中溶解度最低，仅为水的溶液中溶解度最低，仅为水的1%1%，几乎不溶解；而，几乎不溶解；而RNARNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.140.14mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶解溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。蛋白质变性剂去除蛋白质。3

4、3、粘性粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNADNA大于大于RNARNA。核酸变性后，粘度核酸变性后，粘度下降。下降。二、核酸的水解二、核酸的水解粘性末端末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为粘性末端。这种酶在基因工程中应用最多。平头末端在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口三、核酸的两性电离与等电点三、核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有核酸具有两性电离的性质两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。性大

5、于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNADNA的的pIpI约约为为4 45 5，RNARNA的的pIpI约为约为2.02.02.52.5，在，在pH7pH78 8电泳时电泳时泳向正极。泳向正极。四、四、UVUV吸收吸收 ：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在外吸收的的性质，在260260nmnm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。吸收是核酸定量测定的基础。五、五、DNADNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交 DNADNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还双螺旋结构

6、模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释能解释DNADNA的重要特性变性与复性，这对于深入了解的重要特性变性与复性，这对于深入了解DNADNA分子分子结构与功能的关系又有重要意义。结构与功能的关系又有重要意义。（一）（一）DNADNA变性变性(denaturationdenaturation)1 1、DNADNA变性的概念变性的概念：指：指DNADNA分子中的双螺旋结构解链为无规分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。则线性结构的现象。2 2、DNADNA变性的本质变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的

7、改变。的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3 3、导致导致DNADNA变性的因素：变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的加热、极端的pHpH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性均可引起核酸分子变性4 4、变性变性DNADNA的特征：的特征：（1 1）溶液粘度降低：）溶液粘度降低：DNADNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。（2 2）旋光性发生变

8、化：变性后整个）旋光性发生变化：变性后整个DNADNA分子的对称性及分子构分子的对称性及分子构型改变，使型改变，使DNADNA溶液的旋光性发生变化。溶液的旋光性发生变化。（3 3）紫外吸收增强）紫外吸收增强 。增色效应增色效应(hyperchromichyperchromic effect)effect)：指指DNADNA变性后其紫外吸变性后其紫外吸收明显增强的效应。收明显增强的效应。DNADNA分子中碱基间电子的相互作用使分子中碱基间电子的相互作用使DNADNA分分子具有吸收子具有吸收260260nmnm波长紫外光的特性。在波长紫外光的特性。在DNADNA双螺旋结构中碱基双螺旋结构中碱基藏入

9、内侧，变性时藏入内侧，变性时DNADNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。对双链对双链DNADNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNADNA溶液在溶液在260260nmnm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNADNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DN

10、ADNA变性曲线呈变性曲线呈S S型如上型如上图所示。图所示。可见，可见，DNADNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称相类似，又称融解温度融解温度(Tm,melting temperature)Tm,melting temperature)。在在TmTm时，时，核酸分子内核酸分子内50%50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的的双

11、螺旋结构被破坏。特定核酸分子的TmTm值值与其与其G GC C所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：示为：Tm=69.3Tm=69.30.41(G+C)%0.41(G+C)%一定条件下一定条件下(相对较短的核酸分子相对较短的核酸分子)，TmTm值大小值大小还与还与核酸分子的长度核酸分子的长度有关，核酸分子越长，有关，核酸分子越长，TmTm值值越大；另外，越大；另外，溶液的离子强度溶液的离子强度较低时，较低时，TmTm值较低，值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此融点范围也较宽，反之亦然，因此DNADNA制剂不应保制剂不应保存在离子强度过低

12、的溶液中。存在离子强度过低的溶液中。(二二)DNADNA的热变性与复性的热变性与复性(renaturationrenaturation)指经加热变性的指经加热变性的DNADNA在适当条件下，二条互补链全部在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性逆转过程。热变性DNADNA一般经一般经缓慢冷却缓慢冷却后即可复性，此过后即可复性，此过程称之为程称之为退火退火(annealing)annealing)。这一术语也用以描述杂交核这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成酸分子的形成(见后见后)。DNADNA的

13、复性不仅受温度影响，还受的复性不仅受温度影响，还受DNADNA自身特性等其它因自身特性等其它因素的影响：素的影响：1 1、温度和时间：、温度和时间：一般认为比一般认为比Tm Tm 低低2525左右的温度是复性的最佳条件，左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过一缓慢过程，若在超过TmTm的温度下迅速冷却至低温的温度下迅速冷却至低温(如如44以下以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持保持DNADNA的变性的变性(单链单链)状态。这

14、说明降温时间太短以及温状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。差大均不利于复性。2 2、DNADNA浓度：浓度：溶液中溶液中DNADNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。于复性。3、DNA顺序的复杂性：顺序的复杂性：简单顺序的简单顺序的DNADNA分子，如多聚分子，如多聚(A)A)和多聚和多聚(U)U)这二种单链这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。列要实现互补，则困难得多。DNADNA的变性和复性原理，现已在的变性和复性原理，现已在医学医

15、学和和生命科生命科学学上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerasepolymerase chain chain reaction,PCR)reaction,PCR)技术等。技术等。（三）分子杂交：（三）分子杂交：(hybridization)hybridization)不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸基互补配对的片段，复性

16、也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的链之间，即形成所谓的杂化双链杂化双链(heterodup lexheterodup lex)，这个过程称为这个过程称为杂交杂交(hybridization)hybridization)。杂交可以发生于杂交可以发生于DNADNA与与DNADNA之间，也可以发生于之间，也可以发生于RNARNA与与RNARNA之间和之间和DNADNA与与RNARNA之间。之间。例如，一段天然的例如，一段天然的DNADNA和这段和这段DNADNA的缺失突变体的缺失突变体(假定这种突变是假定这种突变是DNADNA分子中部丢失了若干碱基对分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子

17、显微镜下可以看到杂化双链中部鼓一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。生的部位和缺失的多少。核酸的分离纯化测定及研究方法一、分离核酸的一般原则一、分离核酸的一般原则 因因为为遗遗传传信信息息全全部部贮贮存存在在核核酸酸的的一一级级结结构构中中，故故完整的一级结构完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。是保证核酸结构与功能研究的基础。保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：（一）核酸的分

18、离和纯化时应遵循两个原则：（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核核酸酸样样品品中中不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用的的有有机机溶溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；其其它它生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、多多糖糖和和脂脂类类分分子子的的污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度；排排除除其其它它核核酸酸分分子子的的污污染染，如如提提取取DNADNA分分子子时时，应去除应去除RNARNA，反之亦然。反之亦然。核酸的分离纯化测定及研究方法（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整

19、性和纯度，在实验中应注意：尽尽量量简简化化操操作作步步骤骤，缩缩短短提提取取过过程程，以以减减少少各各种种有有害害因因素素对对核酸的破坏；核酸的破坏；减减少少化化学学物物质质对对核核酸酸的的降降解解，为为避避免免过过酸酸、过过碱碱对对核核酸酸链链中中磷酸二酯键的破坏，操作多在磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNADNA酶需要金酶需要金属二价阳离子属二价阳离子MgM

20、g2+2+，CaCa2+2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTAEDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNADNA酶的活性。而酶的活性。而RNARNA酶不但分酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是生物降解是RNARNA提取过程中的主要危害因素；提取过程中的主要危害因素；核酸的分离纯化测定及研究方法 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。切力，其次是高温。机机械械剪

21、剪切切力力包包括括强强力力高高速速的的溶溶液液振振荡荡、搅搅拌拌，细细胞胞突突然然置置于于低低渗渗液液中中；细细胞胞爆爆炸炸式式地地破破裂裂及及DNADNA样样品品的的反反复复冻冻融融等等。这这些些操操作作细细节节在在实实验验操操作作中中应应加加倍倍注注意意。机机械械剪剪切切作作用用的的主主要要危危害害对对象象是是大大分分子子量量的的线线性性DNADNA分分子子，如如真真核核细细胞胞的的染染色色体体DNADNA等等。高高温温，如如长长时时间间煮煮沸沸，除除水水沸沸腾腾带带来来的的剪剪切切力力外外，高高温温本本身身对对核核酸酸分分子子中中的的某某些些化化合合键键也也有有破破坏坏作作用用。核核酸酸

22、提提取取过过程程中中常常规规操操作作温温度度为为0 044以以降降低低核核酸酸酶酶的的活活性性从从而而减减少对核酸的生物降解。少对核酸的生物降解。核酸的分离纯化测定及研究方法二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干纯化干燥燥溶解溶解 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后

23、再提取目的核酸分子酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。酸分子。核酸的分离纯化测定及研究方法三、核酸的测定方法三、核酸的测定方法1、紫外吸收法、紫外吸收法 在一定在一定pHpH下测定样品的紫外吸光度（下测定样品的紫外吸光度（A A260260），），即可由即可由下式计算样品中的核酸含量：下式计算样品中的核酸含量：C=Mr rAA260/L 其其中中：C C为为核核酸酸的的含含量量（mg/mg/mLmL），MrMr为为相相对对分分子子质质量量，A A260260为为核核酸酸溶溶液液的的吸吸光光度

24、度，为为摩摩尔尔消消光光系系数数（即即1 1升升溶溶液液中中含含1 1摩摩尔尔核核酸酸的的光光吸吸收收值值），L L为为比比色色杯杯的的内内径（径（cmcm）核酸的分离纯化测定及研究方法2、定糖法、定糖法 RNARNA的的测测定定：RNARNA分分子子中中所所含含的的核核糖糖经经浓浓硫硫酸酸或或浓浓盐盐酸酸作作用用脱脱水水生生成成糠糠醛醛，糠糠醛醛可可与与3 3，5-5-二二羟羟甲甲苯苯（苔苔黑黑酚酚或或地地衣衣酚酚）反反应应生生成成绿绿色色化化合合物物，该该化化合合物物可可在在670-680670-680nmnm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。DNADNA的的测测定定：DNADNA分

25、分子子中中的的脱脱氧氧核核糖糖在在冰冰醋醋酸酸或或浓浓硫硫酸酸存存在在下下可可与与二二苯苯胺胺反反应应生生成成兰兰色色化化合合物物，该该化化合合物物可可在在595-620595-620nmnm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。3、定磷法、定磷法 RNARNA和和DNADNA中中都都含含有有磷磷酸酸，可可以以进进行行磷磷的的测测定定。纯纯的的核核酸酸中中含含磷磷量量在在9.5%9.5%左左右右，因因此此，测测出出核核酸酸中中的的磷磷含含量量就就可可计计算算核核酸酸的的含含量量。测测定定时时先先将将核核酸酸用用强强酸酸消消化化成成无无机机磷磷酸酸，后后者者与与定定磷磷试试剂剂中中的的钼钼酸酸

26、反反应应生生成成磷磷钼钼酸酸，在在经经过过还还原原作作用用而而生生成成蓝蓝色色的复合物，最后在的复合物，最后在650-660650-660nmnm进行比色测定。进行比色测定。核酸的分离纯化测定及研究方法四核酸研究方法四核酸研究方法 （一）核酸的沉降特性（一）核酸的沉降特性 溶溶液液中中的的核核酸酸在在引引力力场场中中可可以以下下沉沉。在在超超速速离离心心机机造造成成的的强强大大的的离离心心力力场场中中，核核酸酸分分子子下下沉沉的的速速度度大大大大加加快快。核酸的超速离心用于：核酸的超速离心用于：1、测定核酸的浮力密度；、测定核酸的浮力密度；2、测定、测定DNA分子中的分子中的G、C含量；含量；

27、3、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超螺旋螺旋DNA、闭环质粒闭环质粒DNA、开环及线型开环及线型DNA，若样品中含若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。4、核酸的制备。、核酸的制备。核酸的分离纯化测定及研究方法核酸的分离纯化测定及研究方法（二）核酸的凝胶电泳（二）核酸的凝胶电泳 凝凝胶胶电电泳泳是是当当前前核核酸酸研研究究中中最最常常用用的的方方法法，有有琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳、聚聚丙丙烯烯酰酰胺

28、胺凝凝胶胶电电泳泳。前前者者常常用用于于DNADNA的的分分离离分分析析，后后者者用用于于RNARNA的的分分离离分析。分析。五、核酸的序列测定五、核酸的序列测定 DNADNA的一级结构的测定方法的一级结构的测定方法1.1.SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(酶法测序）酶法测序）DNADNA的合成总是从的合成总是从55端向端向33端进行的。端进行的。DNADNA的合成需要模板以的合成需要模板以及相应的引物链。及相应的引物链。DNADNA的合成过程中，在合成的的合成过程中，在合成的DNADNA链的链的33末端，末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的依据碱基配对的原则，通过生成新

29、的3,53,5磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNADNA链合成终止，产生短的链合成终止，产生短的DNADNA链。具体测序工作中，平行进行四链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入使其随机地接入DNADNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的定长度的、不同长短的DNADNA链。这四组链。这四组DNADNA链

30、再经过聚丙烯酸胺凝链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测接读出被测DNADNA的核苷酸序列的核苷酸序列,如下图所示：如下图所示：2.2.MaxamMaxamGilbert DNA Gilbert DNA 化学降解法化学降解法 (1)(1)先将先将DNADNA的末端之一进行标记的末端之一进行标记(通常为放射性同位素通常为放射性同位素3232P P；(2)(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；学修饰；(3)(3)在修饰碱基位置化学法断开在修饰碱基位置化学法断开DNADNA链；链；(4)(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNADNA链按长短分开；链按长短分开；(5)(5)根据放射自显影显示区带，直接读出根据放射自显影显示区带，直接读出DNADNA的核苷酸序列的核苷酸序列,如下图所示：如下图所示：这一方法的基本步骤为这一方法的基本步骤为:化学裂解法化学裂解法测定测定DNADNA的核的核苷酸序列苷酸序列六、六、PCR基本原理基本原理