《造血调控》PPT课件.ppt

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1、造血干细胞的发育调控造血干细胞的发育调控 授课教师：刘授课教师：刘 静静生物科学与技术学院分子生物学研究中心生物科学与技术学院分子生物学研究中心研究方向研究方向1 1：造血发育调控：造血发育调控研究方向研究方向2 2：白血病治疗的分子机制研究：白血病治疗的分子机制研究 造血（造血（hematopoiesis）造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell)分化为早期祖分化为早期祖细胞细胞(primitive progenitor cell)，经增殖分化成为晚期祖，经增殖分化成为晚期祖细胞细胞(late progenitor cell)，再分化为具有特异形态的、，再分化为具

2、有特异形态的、骨髓中不同系别前体细胞骨髓中不同系别前体细胞(precursor cell)，最后分化成为，最后分化成为各类具有生理功能的血细胞的整个过程称为各类具有生理功能的血细胞的整个过程称为“造血造血”。造血不包括成熟血细胞在体内储存、释放、分配造血不包括成熟血细胞在体内储存、释放、分配和凋亡的过程。和凋亡的过程。第一第一节 造血器官造血器官人体的造血器官是生成血液的器官人体的造血器官是生成血液的器官。起源于起源于中胚叶中胚叶，主要包括，主要包括骨髓、胸腺、淋骨髓、胸腺、淋巴巴结、肝肝脏和和脾脾等等。造血造血过过程分程分为为胚胎期造血胚胎期造血和和出生后造血出生后造血。一一、胚胎期造血器官

3、、胚胎期造血器官人人类的血液的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参与造血脾、胸腺和骨髓均参与造血根据根据发发育育过过程中造血中心的程中造血中心的转转移，胚胎期移，胚胎期造血分造血分为为三个三个时时期：期：卵黄囊造血期卵黄囊造血期 、肝造血期、肝造血期 、骨髓造血期、骨髓造血期 胚胎期造血的三个时期不能截然胚胎期造血的三个时期不能截然分开，此消彼长，互为交错。分开，此消彼长，互为交错。二、出生后造血二、出生后造血出生后造血主要靠出生后造血主要靠骨髓骨髓。在正常情况下骨髓是唯一能在正常情况下骨髓是唯一能产产生生红细红细胞、胞、粒粒细细胞和血小板的胞和血小板的

4、场场所，也生成淋巴所，也生成淋巴细细胞胞和和单单核核细细胞。胞。脾脾和和淋巴淋巴结为终生制造生制造淋巴淋巴细胞胞的器官。的器官。一、造血一、造血细胞的生胞的生长发育育 是一个是一个连续连续不断的复不断的复杂过杂过程，造血器官程，造血器官内的各种造血内的各种造血细细胞在造血微胞在造血微环环境中通境中通过细过细胞胞与与细细胞之胞之间间相互作用，在各种相互作用，在各种细细胞因子的胞因子的诱诱导导下，按一定的下，按一定的规规律律发发育成育成为为各种成熟的血各种成熟的血细细胞，然后胞，然后释释放入血循放入血循环环中。中。第二节第二节 造血造血干干/祖祖细胞的生长发育细胞的生长发育特性特性（一）（一）基本

5、基本过程程 造血造血细胞的生胞的生长发育包括育包括增殖、分化、增殖、分化、成熟成熟和和释放放四个方面。四个方面。造血细胞的增殖造血细胞的增殖（proliferation）是指血细胞通过分裂而使其数量增加的是指血细胞通过分裂而使其数量增加的过程。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式过程。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。造血造血细胞的分化（胞的分化（differentiation）细胞胞发育育过程中失去某些潜能程中失去某些潜能而而获得新功能得新功能的的过程，即由多潜能程，即由多潜能转变为单潜能的潜能的过程。程。分裂后的分裂后的细细胞在形胞在形态态和功能上和功能上产产生新的特征，生新的特征，分化分化过

6、程是不可逆的程是不可逆的。造血造血细胞的成熟（胞的成熟（maturation）造血干造血干细胞定向分化，从原始胞定向分化，从原始经幼稚到成熟幼稚到成熟细胞胞的的发育育过程。血程。血细胞越成熟其形胞越成熟其形态越易越易辨辨认，功能也日，功能也日趋完善。成熟的血完善。成熟的血细胞在骨胞在骨髓内通髓内通过“髓血屏障髓血屏障”释放入血循放入血循环中。中。（二）造血（二）造血细胞生胞生长发育育阶段段 根据造血根据造血细胞的功能和形胞的功能和形态特征，造血特征，造血细胞胞生生长发育育阶段可分段可分为：造血干造血干细细胞胞 造血祖造血祖细细胞胞 原始及幼稚原始及幼稚细细胞胞造血干造血干细胞阶细胞阶段段造血祖

7、造血祖细胞阶细胞阶段段原始原始及幼及幼稚细稚细胞阶胞阶段段成成熟熟细细胞胞二、造血干二、造血干细胞胞特性特性干干细胞（胞（stem cell）是具有自我复制和多向分是具有自我复制和多向分化能力的化能力的细胞。胞。早期胚胎中的原始生殖细胞即胚胎干细胞，具早期胚胎中的原始生殖细胞即胚胎干细胞，具有广泛的发育和分化潜能，称为有广泛的发育和分化潜能，称为全能干细胞全能干细胞（totipotent hematopoietic stem cell，THSC）。）。造血干造血干细胞胞又称又称多能干多能干细胞胞，由中胚，由中胚层细胞胞分化而来，是各种血分化而来，是各种血细胞的始祖，具有高度胞的始祖，具有高度自

8、我更新、多向分化和增殖能力，并且在造自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血血组织中含量极少，其形中含量极少，其形态酷似小淋巴酷似小淋巴样细胞而胞而难以辨以辨认。1.造血干造血干细细胞的基本特征胞的基本特征 （1）自我更新（）自我更新（self-renewal）与自我）与自我维持（持（self-maintenance）干干细胞在不断胞在不断产生祖生祖细胞的同胞的同时又保又保持自己数量和自身特性不持自己数量和自身特性不变。高度的自我更新能力是造血干高度的自我更新能力是造血干细细胞胞最最基本的生物学特征之一。基本的生物学特征之一。（2）造血干造血干细细胞静止状胞静止状态态 干干细细胞胞95%以上以

9、上细细胞胞处处于于G0期静止状期静止状态态，不，不进进行行DNA合成和有合成和有丝丝分裂，当机体分裂，当机体发发生缺氧、感染、失血和生缺氧、感染、失血和创伤创伤等等应应激状激状态态时时，干，干细细胞从静止胞从静止进进入增殖的数量增加，入增殖的数量增加，以以满满足机体足机体对对造血的需求。造血的需求。（3）造血干造血干细细胞全能性（胞全能性（多向分化多向分化）分化是分化是不可逆不可逆的，一旦定向分化为某种祖细的，一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其胞，就不可能再变成其它它的祖细胞。的祖细胞。造血干细胞在特定的条件下可以分化成造血干细胞在特定的条件下可以分化成红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板

10、、组织红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、嗜碱细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀淋巴细胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。伤细胞等的祖细胞。（4）造血干细胞不均一性造血干细胞不均一性（heterogeneity）造血干细胞有增殖态与静止态之分，造血干细胞有增殖态与静止态之分，并且不断地在静止和增殖态之间转换。造并且不断地在静止和增殖态之间转换。造血干细胞代龄（有丝分裂的次数）不同构血干细胞代龄（有丝分裂的次数）不同构成了干细胞群体的代龄结构，形成干细胞成了干细胞群体的代龄结构，形成干细胞不均一性。不均一性。2造血干造血干细胞胞检测 单个个细胞在生物体内有能力胞在生物体内有能力长

11、期重建造血是期重建造血是判断判断该细胞胞为造血干造血干细胞的胞的“金金标准准”。造血干造血干细细胞的数量极少，形胞的数量极少，形态态上不能区上不能区别别，干干细胞抗原性弱，胞抗原性弱，仅有很少表面抗原。有很少表面抗原。（1）脾集落）脾集落测试测试法法 1961年年Till等首先采用体内等首先采用体内试验试验小鼠脾集落形成小鼠脾集落形成间间接接证证明了造血干明了造血干细细胞的存在：胞的存在：将受体小鼠以致死将受体小鼠以致死剂剂量射量射线线照射后，破坏全部造血照射后，破坏全部造血细细胞，胞，再再输以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中形成小鼠脾中形成红

12、系、粒系、巨核系系、粒系、巨核系细胞胞结节，这些都些都是由是由单个个细胞增殖分化而来，即脾集落形成胞增殖分化而来，即脾集落形成单位位（CFU-S）。（2）单单克隆抗体法克隆抗体法 CD34+CD38单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等系、巨噬系、巨核系等 细胞分化。细胞分化。CD34+CD38细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能力造血干细胞具有多向分化的能力。利用利用FACS自动细胞分选系统分选出自动细胞分选系统分选出CD34+CD38+及及CD34+CD38亚群细

13、胞亚群细胞。CD34+细胞具有长期重建造血的能力。细胞具有长期重建造血的能力。CD34+CD38细胞比细胞比CD34+细胞具有更强的长期造血能力。细胞具有更强的长期造血能力。（三）造血干祖（三）造血干祖细胞的胞的临床床应用用 造血干祖造血干祖细细胞移植主要胞移植主要应应用于：用于：1.血液系血液系统恶统恶性性肿肿瘤，如急、慢性白血病等瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系血液系统统非非恶恶性性肿肿瘤性疾病，如再生障碍瘤性疾病，如再生障碍性性贫贫血、异常血血、异常血红红蛋白病、蛋白病、Fanconi贫贫血、血、难难治性治性贫贫血等；血等；3.实实体体肿肿瘤化瘤化疗疗后造血重建，如乳腺癌、卵后造血重建

14、，如乳腺癌、卵巢癌、神巢癌、神经经母母细细胞瘤等；胞瘤等；4.其他，如重症其他，如重症联联合免疫缺陷症、自身免疫合免疫缺陷症、自身免疫性疾病、基因治性疾病、基因治疗疗等。等。第三第三节 造血造血调控控造血造血细胞的增殖、分化受控于不同的胞的增殖、分化受控于不同的调控系控系统。其中其中细胞因子的胞因子的调控占重要地位。控占重要地位。细胞因子（细胞因子（cytokines）是一组基因编码的低分子量是一组基因编码的低分子量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能是在

15、细胞间传递信息，从而影响造血活动。是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。一一、集落刺激因子集落刺激因子类(colony-stimulating factors,CSFs)2.粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)除促进粒系祖细胞形成集落外，还可诱导某些白血病细胞株分化成熟。3.粒巨噬细胞集落刺激因子粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化 成熟，对成熟细胞也产生作用。1.红细胞生成素（红细胞生成素（erythropoietin，EPO）刺激红系祖细胞的增殖和分化。4.巨噬巨噬细细胞集落刺激因子（胞集落刺激因子（M-CSF）促进单核系祖细胞的增殖

16、和分化，激活巨噬细胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（多系集落刺激因子（multi-CSF）促进多系集落生长。6.血小板生成素（血小板生成素（thrombopoietin,TPO）促进巨核细胞集落形成。二二、白、白细胞介素胞介素（interleukin,IL)白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与造血系统的造血调控。造血系统的造血调控。三三、其它、其它细胞因子胞因子1.干细胞因子（干细胞因子（stem cell factor,SCF）/肥大细肥大细胞生长因子胞生长因子 促进肥大细

17、胞生长；协同促进造血干祖细胞增殖、分化。2.FLT-3配基配基(FLT-3 ligand,FL)诱导处于静止期的造血干祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。1原癌基因原癌基因 如：如：c-myc基因、基因、ras相关基因、相关基因、c-abl基因、基因、bcl-2 基因、基因、c-kit基因等。基因等。四四、造血基因、造血基因调控控 原癌基因的原癌基因的编码产编码产物可物可为为：细细胞因子、胞因子、细细胞因子受体、胞因子受体、细细胞内蛋白激胞内蛋白激酶酶、细细胞内信号胞内信号传递传递分子及分子及转录转录因子等。因子等。2.抑癌基因抑癌基因 如：如：p53基因、基因、WT1基因、基因、NF1基因、基因

18、、DCC、Rb基因等。抑癌基因基因等。抑癌基因编码产编码产物通常物通常为为细细胞增殖胞增殖负调节负调节因子，抑制因子，抑制细细胞增殖、胞增殖、诱导终诱导终末分化、末分化、维维持基因持基因稳稳定、定、诱导细诱导细胞凋亡等。胞凋亡等。3.转录转录因子参与信号因子参与信号转导转导的的调调控控 对对造血中基本的基因造血中基本的基因调调控机制控机制 仍存在若干仍存在若干悬悬念有待研究：念有待研究：（1）如何在）如何在细细胞周期胞周期G1与与G0之之间间来回来回转转换换，并保持，并保持绝绝大多数大多数细细胞胞处处于于G0静止状静止状态态?（2）干）干细细胞不胞不对对称有称有丝丝分裂在基因水平上分裂在基因水

19、平上是怎是怎样实现样实现的的?（3）干）干/祖祖细细胞基因怎胞基因怎样调样调控各控各类类受体表达，受体表达，以接受造血微以接受造血微环环境中各种信号的影响境中各种信号的影响?（4）干）干细细胞在基因水平如何胞在基因水平如何调调控决定分化控决定分化方向方向?怎怎样样保持各系之保持各系之间间正常恒定比例正常恒定比例?第四第四节 造血干祖造血干祖细胞体外培养技胞体外培养技术 体内造血干祖体内造血干祖细胞在一个极复胞在一个极复杂的造血的造血微微环境中增殖、分化生成血液境中增殖、分化生成血液细胞。胞。体外造血祖体外造血祖细细胞培养就是在体外模胞培养就是在体外模拟拟体内体内的生理的生理环环境，将从机体中分

20、离出的造血祖境，将从机体中分离出的造血祖细细胞胞进进行培养，使之生存、增殖分化。行培养，使之生存、增殖分化。一、造血干祖一、造血干祖细胞体外培养的基本条件胞体外培养的基本条件（一）（一）细胞培养室条件胞培养室条件（二）培养的支持物（二）培养的支持物（三）（三）营营养液养液（四）（四）细细胞因子胞因子（五）血清（五）血清二、造血干祖二、造血干祖细胞体外培养胞体外培养方法方法（一）造血祖（一）造血祖细胞集落培养：胞集落培养：（1）分离培养）分离培养细胞，制成胞，制成单个核个核细胞胞悬液。液。（2）配制培养体系：按比例将培养液、）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、胞、血清、细 胞因子加入到培

21、养体系，混匀。胞因子加入到培养体系，混匀。（3）将配制的培养体系在）将配制的培养体系在37水浴水浴中保温中保温10min。（4）将）将琼脂等支持物煮沸融化（甲基脂等支持物煮沸融化（甲基纤维素不需加素不需加热）。）。（5）待支持物降至）待支持物降至40左右，加入培养体系并混匀。左右，加入培养体系并混匀。（6）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔内，）将混匀后的培养体系加入培养皿或培养板孔内，一般平行做一般平行做3份。份。（7）于）于5%CO2、饱和湿度及和湿度及37温箱内孵育。温箱内孵育。BFU-E 需需14天天，CFU-E需需7天。天。（8）观察察结果。果。红细胞爆式集落形成单位红细胞爆式集

22、落形成单位 （BFU-E）红细胞的祖细胞体外培养红细胞的祖细胞体外培养红细胞集落形成单位红细胞集落形成单位 (CFU-E)（二）（二）红系祖系祖细胞胞诱导分化的液体培养：分化的液体培养：MediumFBSEPOStem cell factorIL3 三、造血祖三、造血祖细胞培养的主要胞培养的主要应用：用：1）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量；）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量；2）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义；）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义；3）利用人工培养条件易于严格控制的特点，研究造）利用人工培养条件易于严格控制的特点，研究造 血调节；血调节；4）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。