《谷氨酸生产》PPT课件.ppt

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1、第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养1 谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质 现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.1 棒状杆菌属棒状杆菌属(Corynebacterium)直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八”字形或栅状排列。G+1.2 短杆菌属短杆菌属(Brevibacterium)短的不分枝直杆菌。G+1.3 小杆菌属小杆菌属(Microbacterium)杆状，与棒杆菌相似。G+1.4 节杆菌属节杆菌属(Arthrobac

2、terium)培养过程中，球菌 杆菌，杆菌 球菌。G+G-,G-G+第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.1 北京棒杆菌北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征的形态和生理特征(1)形态特征 短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。单个、成对及“V”字形排列。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.1 北京棒杆菌北京棒杆菌(AS1299)的形态

3、和生理特征的形态和生理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，24h白色，48h淡黄色，颜色逐渐加深，表面光滑、湿润、有光泽，无黏性，无水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，24h白色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：稍浑浊，有时表面沿管壁呈薄环状，摇动培养管，底部有粒状沉渣。普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长弱，且不向四周扩散。明胶平板及明胶穿刺：菌落形状不规则，扁平，边缘不整齐，淡黄色。穿刺培养时，沿穿刺线生长不明显，表面发育良好。不液化明胶。马铃薯块：培养三周仍

4、不生长。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.1 北京棒杆菌北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，不耐高温，41 生长较弱。pH的影响：Ph510均能生长，最适 pH67.5。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。不水解淀粉。不分解纤维素。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖 生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。第三章第三章 谷

5、氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.2 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征的形态和生理特征(1)形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.2 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征的形态和生理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌

6、胎线状，近草黄色，表面湿润、无光泽，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：稍浑浊，表面有薄菌膜，底部有较多沉渣。普通肉汁琼脂穿刺：表面及沿穿刺线生长，且不向四周扩散。明胶穿刺培养：表面及沿穿刺线生长。不液化明胶。马铃薯块：培养三周仍不生长。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.2 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：

7、兼性厌氧。与温度的关系：菌株2037 培养生长良好，不耐高温，42 不生长。pH的影响：pH69生长良好，pH10生长微弱，pH45已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。水解淀粉。不分解纤维素。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.3 天津短杆菌天津短杆菌(T613)的形态和生理特征的形态和生理特征(1)形态特征 典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆

8、，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。不运动。无芽孢。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.3 天津短杆菌天津短杆菌(T613)的形态和生理特征的形态和生理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状、隆起，浅黄色，表面湿润、有光泽，不透明，不产生水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：浑浊，没有菌盖，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮状和粒状沉渣。普通肉

9、汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长较弱，且不向四周扩散。明胶穿刺培养：表面发育良好，沿穿刺线生长不明显，不液化明胶。马铃薯块：培养15d仍不生长。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.3 天津短杆菌天津短杆菌(T613)的形态和生理特征的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，75 处理10min不再生长。pH的影响：pH610生长良好，pH5生长微弱，pH4和pH11已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。不水解淀粉。不分解纤维素。脲

10、酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.4 北京棒杆菌北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌与钝齿棒杆菌(B9)的比较的比较 后提取容易，收率较高，质量较好分泌色素较多第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.5 天津短杆菌天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌与钝齿杆菌

11、(B9)的比较的比较 T613感染噬菌体时，不能换用B9，调换7338.第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养2 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌及其比较 2.6 目前味精行业采用的主要菌株目前味精行业采用的主要菌株 钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是我国味精行业生产上的重要菌种。二者融合子F263.S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 3.1

12、种子的菌体形态种子的菌体形态 斜面和一、二级种子在不同培养条件下，细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及“V”字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 3.2 谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 长菌型细胞：发酵0

13、-8h或0-10h。短杆至棒状，有的微弯曲状，细胞单个、成对及 V字形排列。转移期细胞：发酵8-18h或10-20h。细胞开始伸长、膨大。在生物素贫乏的条件下，从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型。转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞。产酸型细胞：发酵16-20h后。细胞为含磷脂不足的异常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏V字形排列。发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，产酸高。过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化。菌体较粗壮，类似于长菌型细胞。典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的

14、特征、育种及扩大培养3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 3.3 谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态 发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养4 谷氨酸发酵的代谢控制育种谷氨酸发酵的代谢控制育种 4.1 日常菌种

15、工作日常菌种工作 定期分纯小剂量诱变刺激高产菌制作安瓿管4.2 选育耐高渗透压菌种选育耐高渗透压菌种 耐高糖突变株耐高谷氨酸突变株耐高糖、高谷氨酸突变株 第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养4 谷氨酸发酵的代谢控制育种谷氨酸发酵的代谢控制育种 4.3 选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株 4.4 选育细胞膜渗透性好的突变株选育细胞膜渗透性好的突变株 生物素亚适量、吐温-60、青霉素、温度敏感株4.5 选育强化选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 CO2固定产四碳二羧酸，则糖酸转化率81.7%4.6 选育减弱乙醛酸循环的

16、突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株 4.7 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株酮戊二酸代谢的突变株 4.8 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株4.9 选育强化能量代谢的突变株选育强化能量代谢的突变株第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 5.1 原生质体融合原生质体融合5.1.1 操作步骤操作步骤 标记菌株的选择 原生质体的制备原生质

17、体的再生 原生质体的融合 融合子的选择 实用性菌株的筛选第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 5.1 原生质体融合原生质体融合5.1.2 成功实例成功实例融合子融合子F263 钝齿棒杆菌B9(细胞个体大、易于提取；产酸率低)天津短杆菌TG-866(产酸率高)融合子F263(细胞个体大、产酸率高)融合子融合子FTN9108T613 NTG诱变TN63(寡霉素抗性)TN115(氟乙酸抗性)融合子FTN9108(稳定、产酸率提高)第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸

18、生产菌的特征、育种及扩大培养5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 5.2 转化法转化法受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。5.3 转导法通过温和型噬菌体为媒介，将供体细胞中的DNA片段携带到受体细胞中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 5.4 重组重组DNA技术（基因工程）技术（基因工程）操作步骤：操作步骤：工具酶和载体的选择 目的基

19、因的制备 化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCRDNA体外重组和外源基因的扩增与表达 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养6 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养 发酵罐发酵罐 种子培养过程种子培养过程第三章第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养6 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养和种子的质量要求 影响种子质量的主要因素影响种子质量的主要因素 培养基构成培养基构成 温度温度pH 溶解氧溶解氧 接种量接种量 种龄种龄