《蛋白质测定》PPT课件.ppt

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1、 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定1 1 概述概述2 2 凯氏定氮法凯氏定氮法3 3 氨基酸氮的测定氨基酸氮的测定教学目标 了解蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志；掌握凯氏定氮法、双缩脲法、茚三酮比色法、氨基态氮的测定方法及原理。重点掌握：蛋白质系数的概念；凯氏定氮中各种试剂的用途；凯氏定氮装置的原理及操作技能；掌握PH计甲醛滴定法测定氨基态氮的原理、方法及其操作技能。教学内容（重点及难点）1、凯氏定氮法（蛋白质系数，氮与蛋白质之间的关系，各种试剂的用途，各种步骤的目的及注意事项）2、氨基态氮的测定（甲醛固定氨基的作用；不同PH值指示的滴定意义）第一节第一节 概述概述蛋蛋白白质质是是

2、生生命命的的物物质质基基础础，也也是是食食品中重要的营养指标。品中重要的营养指标。食食品品中中的的蛋蛋白白质质种种类类非非常常复复杂杂，蛋蛋白白质质分分子子量量的的变变化化范范围围通通常常为为50001000,000道道尔尔顿顿，它它们们包包括括氢氢、碳、碳、氮、氧和硫等元素。氮、氧和硫等元素。l测定原理测定原理l食物中碳水化合物、脂肪中只含有食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H、O，不含有氮，不含有氮，含氮是蛋白质区别于其他含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志，有机化合物的主要标志，是存在于蛋白是存在于蛋白质中最为质中最为特征特征的元素。的元素。蛋白质由氨基酸以不同比例构成；蛋白质由氨

3、基酸以不同比例构成；氨基酸由氨基酸由C、H、O、N以不同方以不同方法构成；法构成；由由于于氨氨基基酸酸种种类类不不同同和和蛋蛋白白质质中中氨氨基基酸酸构构成成比比例例不不同同导导致致蛋蛋白白质质的的含氮量不同含氮量不同 不同食品中不同食品中蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量为为13.4%19.1%因此，一般蛋白质含氮量为因此，一般蛋白质含氮量为16%16%，1 1份氮相当于份氮相当于6.256.25份蛋白份蛋白质，此数值（质，此数值（6.256.25）称为蛋白质）称为蛋白质系数，是一个平均值。系数，是一个平均值。*蛋白质系数蛋白质系数16%有一前提：这些氮元素都是指的是蛋白质里的氮元素，因此，当这些

4、氮元素来源于氮元素含量极高的三聚氰胺时，是无法用蛋白质系数返算为产品中蛋白含量的。食食品品中中的的总总有有机机氮氮主主要要来来自自于于蛋蛋白白质质，小小部部分分来来自自于于非非蛋蛋白白质质组组份份的的有机氮，会干扰蛋白质的测定。有机氮，会干扰蛋白质的测定。食食品品中中脂脂类类和和碳碳水水化化合合物物可可能能会会干干扰扰 一一些些具具有有相相似似的的物物化化性性质质的的组组份份干干扰分析。扰分析。干扰蛋白分析物质干扰蛋白分析物质:凯氏定氮法包括有：凯氏定氮法包括有：常量法、微量法、常量法、微量法、经改进后的改良凯氏定氮法经改进后的改良凯氏定氮法这三种方法的不同之处在于：这三种方法的不同之处在于：

5、仪器、装置、试剂等仪器、装置、试剂等都有了改进都有了改进二、二、凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法测定的是凯氏定氮法测定的是粗蛋白粗蛋白的含量的含量 因样品中常含有核酸、生物碱、因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等作蛋含氮类脂、卟啉以及含氮色素等作蛋白质的含氮化合物，故凯氏定氮法通白质的含氮化合物，故凯氏定氮法通常将测定结果称为粗蛋白质含量。常将测定结果称为粗蛋白质含量。2.1.2 凯氏定氮过程步骤：凯氏定氮过程步骤：样品制备样品制备(自学自学)消化消化 蒸馏蒸馏 吸收与滴定吸收与滴定*学习中特别需要注意掌握各个过学习中特别需要注意掌握各个过程中所使用的试剂都有哪些作用程中所使

6、用的试剂都有哪些作用2.1常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法1.原理原理 消化：消化：样品与浓硫酸和催化剂样品与浓硫酸和催化剂一同加热，使蛋白质分解，其中碳和一同加热，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的品中的有机氮转化为氨有机氮转化为氨与硫酸结合成与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵。碱化蒸馏：然后加碱蒸馏，使碱化蒸馏：然后加碱蒸馏，使氨蒸出氨蒸出。吸收与滴定：吸收与滴定：用用H3BO3吸收吸收后生成硼酸氨；后生成硼酸氨；再以标准再以标准HCl溶液滴定；溶液滴定；根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。含量。2.1.2

7、.2 湿法消化湿法消化蛋蛋白白质质中中的的氮氮形形成成铵铵离离子子和和硫硫酸酸结结合成硫酸铵，合成硫酸铵，硫硫酸酸氧氧化化有有机机物物使使碳碳元元素素和和氧氧元元素素被转化成二氧化碳和水。被转化成二氧化碳和水。样品中的有机物消化至透明澄清样品中的有机物消化至透明澄清.加硫酸作用：加硫酸作用：l浓硫酸具有脱水性脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。l 浓硫酸又有氧化性氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫加入量不能太大：否则消化体系温加入量不能太大：否则消化体系温度过高，生成的铵盐发生热分解放出氨度过高，生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。而造成损失。也可以加入硫酸钠、氯

8、化钾提高沸也可以加入硫酸钠、氯化钾提高沸点，效果较差点，效果较差 硫酸钾：硫酸钾：增温剂，提高溶液沸点增温剂，提高溶液沸点加速蛋白质的分解，缩短消化时间，加速蛋白质的分解，缩短消化时间，加入催化剂：加入催化剂：加硫酸铜作用：加硫酸铜作用：加速有机物的氧化与分解加速有机物的氧化与分解有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮绿色，可指示消化终点的到达绿色，可指示消化终点的到达2.1.2.3 碱化、蒸馏 消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使溶液呈碱性，加热蒸馏，释放出氨气吸收与滴定 4%硼酸吸收；盐酸

9、标准溶液滴定；指示剂为混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）。甲基红溴甲基酚绿混合指示剂终点判断：指示剂在反应过程中色泽变化:（酸性条件下为甲基红所显的红色，当体系变为绿色时则呈现溴甲基酚绿所有的绿色，因此，称为混合指示剂）指示剂先加入硼酸中，呈现酸性红色，通入氨气后呈现变蓝绿色；用HCL一滴定，到后来又显了稍过量盐酸的酸性红色定氮装置一、1、电炉；2、水蒸气发生器；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管9、蒸馏液接收瓶。定氮装置二定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指

10、示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。本实验的定量以氮原子的去向为准一开始是蛋白-氨气-硼酸胺所以必须关注这三种物质不能在检测过程中的损失，无论在消化还是吸收或是滴定过程中，都要保证其不损失2.1.4 计算新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，先测定总氮量，然后乘白质为主体，先测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，得

11、到蛋白质含量。以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量。换算系数换算系数一般为一般为6.25（100/16=6.25）。）。即：即：%N 6.25=%蛋白质蛋白质 消化过程操作注意事项：消化过程操作注意事项：消化时不用强火，保持和缓沸腾，以消化时不用强火，保持和缓沸腾，以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。氮损失。消化过程中应不时转动凯氏烧瓶，利消化过程中应不时转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化完全。下，促进其消化完全。问题问题1:

12、1:为什么凯氏定氮所用为什么凯氏定氮所用试剂溶液应用试剂溶液应用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制配制,如何配制。如何配制。问题二：加硫酸铜作用问题二：加硫酸铜作用l起催化剂的作用。起催化剂的作用。l 还可指示消化终点的到达，为清澈还可指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。的蓝绿色。l 指示蒸馏时的碱加入量是否足够指示蒸馏时的碱加入量是否足够。问题三：消化过程中是否有大量的泡问题三：消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么，如何解决？冲到瓶颈，原因是什么，如何解决？样品中若含脂肪或糖较多样品中若含脂肪或糖较多 开始消化时应用开始消化时应用小火加热小火加热，并时，并时时时摇动摇动；或者；或者加入少量辛醇

13、或液体加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂石蜡或硅油消泡剂，并同时注意，并同时注意控控制热源强度制热源强度。消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，含有特别难以氨化的氮化合物的样品，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝蓝色或浅绿色色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色深绿色。问题四：如何判断消化的终点？问题四：如何判断消化的终点？问题五：蒸馏前若加碱量不足会问题五：蒸馏前若加碱量不足会出现什么现象，为什么，如何解决出现什么现象，为什么，如何解决？若加碱量充足，消化液变为深蓝若加碱量充足，消化液变为深蓝色，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若色，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若加碱量不足，则消化液呈蓝色而

14、无加碱量不足，则消化液呈蓝色而无沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。l 蒸馏完毕蒸馏完毕 先将冷凝管下先将冷凝管下端提离液面清洗管口端提离液面清洗管口 再蒸再蒸1分分钟，用表面皿接几滴馏出液，以钟，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查如无红棕色物生奈氏试剂检查如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。热。（避免吸收液倒吸）（避免吸收液倒吸）问题六：蒸馏完毕拆下装置时的注意事项 不能超过不能超过40，否则对氨，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，的吸收作用减弱而造成损失，可置于冷水浴中使用。可置于冷水浴中使用。问题七：为何要控制硼酸吸收液

15、问题七：为何要控制硼酸吸收液的温度？的温度？问题八：混合指示剂颜色：问题八：混合指示剂颜色：在碱性溶液中呈在碱性溶液中呈绿色绿色，在中性溶液，在中性溶液中中呈灰色呈灰色，在酸性溶液中，在酸性溶液中呈红色呈红色。问题九：硫酸与盐酸滴定的区别问题九：硫酸与盐酸滴定的区别l注意：H2SO4 与 HCL的区别l1/2（H2SO4）=HCL优点：优点：1可用于所有食品的蛋白质分析。可用于所有食品的蛋白质分析。2操作比较简单。操作比较简单。3实验费用低。实验费用低。4结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。5用微量法可测定样品中微量的蛋白质。用微量法可测定样品中微量的蛋

16、白质。缺点缺点 1最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。2实验时间太长。实验时间太长。3所用试剂有腐蚀性。所用试剂有腐蚀性。本实验方法的优、缺点本实验方法的优、缺点2.2 2.2 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量有有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。2.3常量改良凯氏定氮法常量改良凯氏定氮法2.3.1 2.3.1 原理及适用范围同前原理及适用范围同前 在凯氏法改良

17、中主要的问题是：在凯氏法改良中主要的问题是：氮的完全氮化、缩短时间、简化氮的完全氮化、缩短时间、简化操作操作 这里主要需解决的是催化剂的种这里主要需解决的是催化剂的种类、硫酸和盐类的添加量等。类、硫酸和盐类的添加量等。2.3.2 2.3.2 特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消化完毕。分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总和滴定，自动数字显示装置。

18、可计算总氮百分含量并记录，氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？加入数粒玻璃珠的作用是什么？凯氏定氮瓶的结构对于定氮操作：内层加消化液、加碱液是反应发生器。外层加无氨蒸馏水、加热产生蒸汽-蒸汽从内外两层连接小口处通入，对反应液进行水蒸气蒸馏。还有一部分是氨气冷凝装置。对于定氮瓶清洗操作：倒吸-需有压力差（内层压力应大，外层压力应小才能产生倒吸）-由于本实验装置中无产生压力装置，是利用了大气压力，和冷却水快速流过细玻璃管所产生的负压之间的压差-找寻大气压力入口，找寻负压产生入口及负压的封闭系统三、双缩脲法三、双缩脲法原理：原理：碱碱性性

19、条条件件下下，铜铜离离子子和和多多肽肽（至至少少有有二二个个肽肽键键，如如多多肽肽和和所所有有的的蛋蛋白白质质）生生成成的的复复合合物物呈呈紫紫红红色色，吸吸收收波波长长为为560nm，比比色色所所得得的的吸吸光光度度值值和和样样品品中中蛋白质的含量成正比。蛋白质的含量成正比。样品的测定：样品的测定：自学自学氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法电位滴定法四、氨基酸态氮的测定4.1 双指示剂甲醛滴定法原理：氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱基和碱性的性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，-N

20、H2基与甲醛基与甲醛结合，从而使其碱性消失。结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。的总量。吸取含氨基酸约吸取含氨基酸约20mg20mg的样品溶液于的样品溶液于100ml100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0ml20.0ml置于置于200ml200ml烧杯中，加水烧杯中，加水60ml60ml，开动，开动磁力搅拌器，用磁力搅拌器，用0.05mol/l0.05mol/l氢氧化钠标准溶氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示液滴定至酸度计指示pH8

21、.2pH8.2，记录消耗氢氧，记录消耗氢氧化钠标准溶液化钠标准溶液mlml数（数（V V1010），供计算总酸含），供计算总酸含量。量。加入加入10.0ml10.0ml甲醛溶液，混匀。再用上甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2pH9.2，记，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。录消耗氢氧化钠标准溶液体积。而真正样品中强碱标准溶液滴定而真正样品中强碱标准溶液滴定-COOH基的过程是指基的过程是指:此法准确快速，适用于测定食品中游离此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。氨基酸。固体样品应先进行粉碎，准确称样后用固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃

22、取，然后测定萃取液；液体试样如酱水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。油、饮料等可直接吸取试样进行测定。但不适合颜色较深或浑浊的样品测定。但不适合颜色较深或浑浊的样品测定。说明及注意事项说明及注意事项4.2 电位滴定法原理：电位滴定法原理：根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。五、茚三酮比色法五、茚三酮比色法原理原理 氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨

23、茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为含量成正比，其最大吸收波长为570nm570nm，故，故据可以测定样品中氨基酸含量。据可以测定样品中氨基酸含量。l1、凯氏定氮法是通过对样品总氮量的测定换算出蛋白质的含量，这是因为 。l2凯氏定氮法消化过程中H2SO4的作用是 ；CuSO4的作用是 。l3凯氏定氮法的主要操作步骤分为消化、蒸馏、吸收、滴定；在消化步骤中，需加入少量辛醇并注意控制热源强度，目的是 ；在蒸馏步骤中，清洗仪器后从进样

24、口先加入 ，然后将吸收液置于冷凝管下端并要求 ，再从进样口加 入 20%NaOH至反应管内的溶液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，然后通水蒸汽进行蒸馏；蒸馏完毕，首先应 ，再停火断气。凯氏定氮法共分四个步骤、。消化时还可加入、助氧化剂。消化加热应注意，含糖或脂肪多的样品应加入作消泡剂。消化完毕时，溶液应呈颜色。凯氏定氮法加碱进行蒸馏时，加入NaOH 后溶液呈 色。4.K2SO4在定氮法中消化过程的作用是().A.催化 B.显色 C.氧化 D.提高温度5.凯氏定氮法碱化蒸馏后,用()作吸收液.A.硼酸溶液 B.NaoH液 C.萘氏试纸 D.蒸馏水用甲基红溴甲酚绿混合指示剂，其在碱性溶液中呈 色，在中性溶液中呈色，在酸性溶液中呈色。双指示剂法测氨基酸总量，所用的指示剂是。此法适用于测定食品中氨基酸。若样品颜色较深，可用处理或用 方法测定。凯代定氮法加入CuSO4的目的是 。蒸馏完毕后，先把，再停止加热蒸馏，防止倒吸。配制无氨蒸馏水应加入、来制备。l二、简答题：二、简答题：l1、请叙述测定黄豆中蛋白质含量的样品消化操作步骤。l2、简述凯氏定氮法的基本原理,及在测定过程中所用试剂的用途。l3、当待测样品中含有三聚氰胺时可否用凯氏定氮法测量，为什么，可用什么方法进行测量。