实验一双向琼脂扩散试验.pptx

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1、第1页/共23页第2页/共23页第3页/共23页第4页/共23页实验目的：了解双向琼脂扩散的原理和用途。掌握抗体效价的测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。第5页/共23页可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。实验原理第6页/共23页第7页/共23页将可溶性抗

2、原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。双向琼脂扩散试验第8页/共23页一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。第9页/共23页 免疫学及免疫学检验 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab沉淀线

3、形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系第10页/共23页 免疫学及免疫学检验 (1)沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2)沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3)沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4)沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原第11页/共23页抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。免疫学及免疫学检验第12页/共23页材料与试剂1琼脂粉2平皿3打孔器4生理盐水或其他缓冲液5.抗原、抗

4、体第13页/共23页第14页/共23页操作方法1称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理盐水或缓冲液，煮沸融化。2将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm3mm。自然冷却。3根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径35mm）打成梅花形孔图。第15页/共23页第16页/共23页4挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6吸取样品加入孔内(约15ul)，以加满为度。7加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37自由扩散24h48h。第17页/共23页第18页/共23页第19页/共23页结果判定用以

5、检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。第20页/共23页213456双向免疫扩散凝胶染色图第21页/共23页1.1.双扩散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断：以以以以IBDIBD诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加IBDIBD标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别加加加加IBDIBD标准抗原、生

6、理盐水、标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、待检抗原。待检抗原。待检抗原。待检抗原。2.2.双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：以以以以免疫鸡免疫鸡免疫鸡免疫鸡IBDIBD抗体检测为例，中抗体检测为例，中抗体检测为例，中抗体检测为例，中心孔加心孔加心孔加心孔加IBDIBD标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔分别加分别加分别加分别加IBDIBD标准阳性血清标准阳性血清标准阳性血清标准阳性血清.、IBDIBD阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清。第22页/共23页感谢您的观看！第23页/共23页